CPPU诱导的小麦差异表达蛋白分析及编码基因的克隆

摘要

CPPU(N-(2-chloro-4-pyridyl)-N’-phenylurea，英文通用名：forchlorfenuron)是一种人工合成的吡啶取代脲类细胞分裂素，它的生理活性超过了玉米素。前期试验发现，用CPPU处理小麦能促使小麦分蘖。而分蘖是影响小麦等主要农作物穗数多少并进而影响单产的重要农艺性状之一。本研究通过蛋白质双向电泳和质谱技术，研究CPPU处理引起的小麦差异表达谱，找到与生长素和细胞分裂素合成有关的两个蛋白。采用生物信息学分析、基因克隆、荧光定量RT-PCR分析、载体构建及遗传转化等方法，克隆获得了小麦TatRNAIPT和TaYUCCA两个新的基因并对其进行了表达特性分析，对TaYUCCA的功能做了初步研究，主要研究结果如下：
　　 1.CPPU对小麦分蘖的影响。室内试验表明，CPPU处理可诱导小麦产生分蘖，CPPU诱导小麦发生分蘖的较适宜浓度为6μmol/L。大田中小麦成熟后统计不同CPPU浓度处理的单株有效分蘖数表明，小麦单株有效分蘖数随处理浓度的提高呈现先上升后下降的趋势，用6μmol/LCPPU处理的小麦单株有效分蘖数最多。
　　 2.CPPU诱导小麦差异表达蛋白分析。与对照相比，CPPU处理后发现有10个差异蛋白点表达量显著上调，将这10个蛋白质点进行MALDI-TOF-TOF分析，获得其肽质量指纹图谱，根据肽质量指纹图谱数据，在Mascot网站进行检索，得出这10个蛋白点分别是tRNA的二甲基转移酶、ABC转运ATP结合蛋白y4tS、核糖体RNA大亚基甲基转移酶、微管结合蛋白6、激动蛋白-66、线粒体ATP合酶α亚基、S-腺苷甲硫氨酸合成酶1、黄素单加氧酶YUCCA4、GTPaseobg和核糖体RNA小亚基甲基转移酶G。这些蛋白质与植物激素合成、植物胁迫反应、能量代谢、蛋白质合成、细胞骨架建构和运输有关。
　　 3.克隆到小麦TatRNAIPT和TaYUCCA基因并进行序列分析。从小麦中克隆获得TatRNAIPT和TaYUCCA两个基因，TatRNAIPT基因编码466个氨基酸残基，TaYUCCA基因编码382个氨基酸残基。利用生物信息学软件对TatRNAIPT和TaYUCCA进行分析，信号肽预测显示这两个基因编码蛋白均不含有信号肽，可能在细胞质中行使功能。BLAST序列比对显示TatRNAIPT氨基酸序列含特征功能域：P-loopNTPase超家族，TaYUCCA氨基酸序列含特征功能域：Pyrredox超家族。聚类分析表明TatRNAIPT与已报道的水稻OstRNAIP工具有较高相似性，TaYUCCA与短柄草BdYUCCA具有较高的相似性。
　　 4.TaYUCCA基因的表达分析。实时荧光定量RT-PCR分析表明，与水对照相比，6μmol/LCPPU处理24h、48h后TaYUCCA基因均上调表达，其中处理48h后TaYUCCA基因表达被诱导上调的幅度较大。将萌发的小麦种子的四个部分做半定量RT-PCR，结果表明与芽尖和芽中间部位相比，分蘖部位和根部TaYUCCA基因的表达量较高。
　　 5.构建了TaYUCCA植物表达载体并初步分析了基因的功能。通过农杆菌浸花法转化拟南芥，获得转TaYUCCA拟南芥植株。与野生型相比，转基因拟南芥出芽较野生型晚，下胚轴明显伸长且叶子卷曲。
　　 本研究利用蛋白质双向电泳和质谱分析技术分析了CPPU处理小麦引起的差异表达蛋白，并首次克隆到与生长素和细胞分裂素合成相关的两个基因TaYUCCA和TatRNAIPT的全长序列，分析了序列结构特点和基因表达特性，构建了植物表达载体，并对转TaYUCCA拟南芥的生长性状进行观察。为这些基因的功能研究奠定了一定的基础。