鸭黄病毒BZ株的生物学特性及在鸭体内的组织学定位研究

摘要

自2010年4月以来，在我国大部分养鸭地区陆续发生了一种以感染种鸭和雏鸭为主的疫病，该病以蛋种鸭采食量和产蛋严重下降、后期出现神经症状和雏鸭出现震颤、翻个等神经症状为主要危害特征。通过临床症状、病理剖检，病原分离和鉴定、外源病毒检测和分子序列测定等证实，该病原是一种新的鸭病毒即鸭黄病毒(DuckFlavivirus，DFV)。对鸭黄病毒感染尚无特异性疗法，由于缺乏有效预防，造成该病传播迅速、波及面广，几乎席卷包括浙江、江苏、安徽、山东等中国东部养鸭密集地区，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。
　　 1.鸭黄病毒BZ株的分离鉴定及生物学特性分析
　　 从产蛋下降的樱桃谷种鸭分离出1株病毒，命名为BZ株。按常规方法对分离毒进行鉴定，结果表明：病毒与H5和H9禽流感病毒(AIV)，鸭瘟病毒(DEV)，新城疫病毒(NDV)等单因子血清无交叉反应。参考Bagazavirus和Japaneseencephalitisvirse等黄病毒属代表株基因组的非结构蛋白NS1基因序列设计引物，进行RT-PCR扩增，结果得到大小约为1061bp的目的条带，结果发现：病毒与以色列火鸡脑膜脑炎病毒(Israelturkeymeningo-encephalitisvirus，TEMV)和在马来西亚发现的Tembumu病毒至少在2段基因上具有较高的同源性，属于黄病毒属生物学特性研究表明：该病毒为有囊膜的单股RNA病毒，对氯仿、酸和去氧胆酸钠敏感，不耐热，MgCL2不起保护作用。病毒无血凝性，不能凝集鸡、鸭、鹅和鸽的红细胞，可适应鸡胚和鸭胚，并可在鸭胚成纤维细胞(DEF)上增殖并产生典型细胞病变，但不能在鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖。经卵黄囊途径接种的SPF鸡胚以绒毛尿囊膜的含毒量最高，其次为尿囊液，胚体的含毒量最低。
　　 2.鸭黄病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用
　　 根据鸭黄病毒的NS1基因序列设计了一对特异性引物和TaqMan探针，建立了实时荧光定量RT-PCR检测病毒的方法。该方法具有特异性，对鸭病毒性肝炎病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、腺病毒、鸭瘟病毒、猪乙脑病毒等无反应。根据目的扩增片段的质粒拷贝数与定量反应Ct值的关系，绘制了标准曲线(Y=-3.39X+43.18，r=0.973)。敏感性试验显示建立的此方法最低可检出1.9个TCID50病毒核酸。该方法对5只健康雏鸭人工感染86小时后的组织器官样品(盲肠扁桃体除外)的检测结果均为阳性，与病毒
　　 分离的符合率为100％，再次证实了方法的可靠性，而且从核酸提取到出结果不超过3h，是一种快速、敏感、特异的定量检测方法。
　　 3.不同途径人工感染雏鸭体内鸭黄病毒的比较研究及组织学定位
　　 将200只2日龄雏鸭随机分组：设脑内、颈部皮下和口鼻眼三种接种组，设相关对照，分别用105.9TCID50/0.1mL的DFV攻毒。利用已建立的荧光定量RT-PCR方法检测病毒在雏鸭体内各组织的动态分布。结果显示：DFV经不同途径感染雏鸭后，病毒在体内的动态分布有一定的差异：接种6h时，脑内接种组可在脑，脾、盲肠扁桃体中检测到病毒RNA，颈部皮下接种组可在脾中检测到，滴鼻点眼口服组可在脾、气管、盲肠扁桃体、法氏囊中检测到；接种初期受检组织的病毒RNA含量，脑内接种组最高，滴鼻点眼口服组最低。同种接种途径在不同的组织器官的分布不同，脑内接种组，24h时各受检组织均可检测到DFVRNA，60h时含量达到最高，其中心的含量最高，气管的含量最低，84h时各组织病毒含量相对较低；其他两组的动态曲线分布一致，但相对滞后。上述3种不同的感染途径，受检组织内的病毒含量心脏、肝、脾、肺、肾、脑含量较高，胰腺、十二指肠、法氏囊、气管、盲肠扁桃体等含量相对较低。本研究为阐明DFV的致病机理提供了重要的试验数据。