棉花中一个新的Parvulin类型肽酰脯氨酰顺反异构酶的功能分析

摘要

蛋白质的正确折叠是其发挥生物学功能的基础。在细胞内，分子伴侣及折叠酶可以帮助蛋白质完成正确折叠。折叠酶主要包括肽酰脯氨酰顺反异构酶(PPI)和蛋白质二硫键异构酶(PDI)。其中，PPI能通过催化肽酰脯氨酰键的异构化加速并帮助蛋白质的正确折叠。到目前为止，PPI的研究主要集中在哺乳动物和原核生物中，植物体内的研究极少。作物在生长发育过程中通常会受到胁迫的影响，在逆境下，蛋白质会因变性而导致生物功能的丧失，分子伴侣及折叠酶在维持蛋白质天然构象方面起非常重要的作用。盐胁迫是危害农作物的主要非生物胁迫之一，盐胁迫下会导致某些基因的表达上调或下调，对这些基因及其编码蛋白的研究有助于阐明抗盐机制并对提高作物抗盐能力提供了理论依据。我们对前期筛选到的一个棉花盐胁迫下表达上调的基因AY972810进行功能分析研究，主要结果如下：
　　 (1)氨基酸序列同源性分析表明棉花耐盐基因AY972810编码的蛋白质属于PPI中的Parvulins家族。利用美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库，BLAST比对发现，该基因编码包含140个氨基酸残基的蛋白质，其中48-140位氨基酸之间即C末端具有parvulin类型的PPI结构域。用SWISS-MODEL在线软件工具进行同源搜索，也发现该基因编码的蛋白在41-140位氨基酸之间具有parvulin型结构域保守区。根据两个数据库的同源分析，预测该蛋白属于PPI中parvulin家族中的成员，我们将该基因编码的蛋白质命名为GhPPI。
　　 (2)同源蛋白聚类分析表明GhPPI与AtPin2、LjPar2进化距离比较近。为了确定GhPPI在parvulin家族中的位置，我们使用MEGA4.1软件对同源性较高的20种生物中此类蛋白进行聚类分析并绘制了进化树。结果表明，GhPPI和百脉根LjPar2同源性高达91％，与拟南芥AtPin2、水稻及玉米PPI同源性高达80％多。与人的hPar14及小鼠、变形虫等中的PPI同源性也达到55％，表明该类蛋白在进化上高度保守。除了C-端PPI酶结构域高度保守外，GhPPI的N-端富含Lys(K)，与人类的hPar14、hPar17的N端同源性比较高。
　　 (3)基因AY972810原核表达产物具有PPI酶活性。将该基因构建到pET30a载体上并转入大肠杆菌中进行原核表达，在编码蛋白的N末端添加His标签，利用His-tag亲和层析的方法纯化该蛋白。以含有脯氨酸的小肽为底物，分析该蛋白催化的肽酰脯氨酰键顺反异构转换活性。结果表明该蛋白具有PPI活性，可以催化肽酰脯氨酰顺反结构之间的转换，且催化反应的速度依赖于PPI浓度。根据我们对NCBI数据库查找，这是植物中首次鉴定到的与盐胁迫有关的parvulin家族PPI成员。
　　 (4)通过同源建模及分子对接推测了GhPPI的必需氨基酸残基。利用分子模拟同源建模建立了GhPPI的三维空间结构，与parvulin家族其他成员结构域同源性比较找出了7个GhPPI对应位置的保守氨基酸残基；用autodock4.0分子对接软件对GhPPI和底物进行对接模拟，找出了GhPPI中可能参与底物结合及催化的氨基酸残基，共11个，其中包括了用分子模拟同源建模预测的7个氨基酸残基。这两种方法推测的结果基本吻合。
　　 (5)通过化学修饰及定点突变的方法确定GhPPI的必需氨基酸。用专一性化学修饰法对可能的必需氨基酸进行了初步检测。结合同源建模、分子对接及化学修饰的结果，选择了11个氨基酸位点，对编码基因进行了定位突变，经原核表达和蛋白纯化后，研究了不同位点对PPI活性的影响。其中5个位点氨基酸即H48、H131、H134、F111和C90突变后，酶活性下降60％以上；2个位点氨基酸即M107和T130突变后，酶活性下降30％左右。以上结合化学修饰、结构模拟及分子对接结果，我们认为这7个氨基酸为GhPPI的活性必需氨基酸。
　　 (6)GhPPI也具有分子伴侣活性。GhPPI能抑制变性的肌酸激酶在稀释复性过程中的聚沉，初步说明GhPPI具有分子伴侣活性。突变体PPI活性分析表明，C90、M107及H134位点突变后，抑制聚沉的能力下降。
　　 (7)棉花GhPPI在盐胁迫下上调表达，而我们的实验又证实了它具有异构酶及分子伴侣活性，这表明它的分子伴侣及折叠酶功能可能在植物的逆境胁迫中起非常重要的作用。