棉花促丝裂原活化蛋白激酶激酶基因(GhMKK1)的分离及功能分析

摘要

植物在其生长过程中不断地遭受外界环境的影响，促丝裂原活化蛋白激酶激酶(Mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK)作为MAPK级联信号传递系统(MAPKs)的一部分，在植物响应逆境胁迫中发挥了关键的作用。大量研究表明，MAPKK不仅在响应生物胁迫方面表现出调节功能，而且在响应非生物胁迫方面也发挥了重要的作用。然而，目前关于MAPKK响应外界环境胁迫的研究大多集中在拟南芥等模式植物上，有关农作物中的MAPKK基因研究很少。棉花，作为重要的农作物之一，具有重要的经济价值和社会效益。因此，本研究以陆地棉（Gossypium hirsutum L.）（鲁棉22）为材料，利用同源克隆的方法分离得到一个新的A组MAPKK基因，命名为GhMKK1，并对其进行了序列比对、表达特性分析和功能鉴定，具体研究结果如下:
　　 (1)基因全长序列测定表明，该基因cDNA全长为1234个核苷酸，包括21bp的5’非编码区(Untranslated region，UTR)，127bp的3'UTR和1086bp的开放阅读框(Openreading frame，ORF)。ORF编码一个361个氨基酸的多肽，预测其分子量大约为39.945kDa，pI值为5.08。该基因推导的氨基酸序列比对及聚类分析表明，棉花GhMKK1与欧芹PcMKK2、番茄LeMKK1、拟南芥AtMKK1及AtMKK2同源性较高，这些较高同源性的基因都属于MAPKK中的A组。以上结果表明，我们分离得到的是棉花A组的MAPKK基因，并命名为GhMKK1。
　　 (2)采用RT-PCR的方法对GhMKK1基因在棉花受到外界胁迫时的表达特性进行了研究。结果表明，GhMKK1转录水平受高盐、机械损伤、过氧化氢(Hydrogen peroxide，H2O2)、聚乙二醇(PEG)、低温(4。C)等非生物胁迫诱导而提高;棉花幼苗受棉花青枯病菌（Ralstonia solanacearum）诱导后，GhMKK1表达量也有所提高;激素信号分子水杨酸(Salicylic acid，SA)和脱落酸(Abscissic acid, ABA)也能不同程度地诱导GhMKK1基因的表达，以上结果表明GhMKK1可能在自身防御过程中发挥了重要作用。
　　 (3)将GhMKK1构建35S-GhMKK1∶:GFP融合蛋白，采用基因枪方法将融合蛋白转入到洋葱表皮细胞中，利用荧光显微镜观察发现，该基因定位于细胞核及细胞质中，这为GhMKK1发挥功能提供了组织依据。
　　 (4)将GhMKK1构建正义植物表达载体pB I121-GhMKK1，采用农杆菌介导的方法转化本生烟（Nicotiana benthamiana）。对部分转基因植株进行RT-PCR分析，结果证明GhMKK1在转基因本生烟中成功表达，进一步通过自交得到T1代过表达植株。在分子鉴定基础上，通过RT-PCR检测了T1代转基因植株中GhMKK1的表达水平。以非转基因的本生烟为对照，超表达GhMKK1的T3代转基因植株增加了对高盐、干旱等非生物胁迫的抗性，我们推测该基因可能正调控非生物胁迫抗性。
　　 (5)超表达GhMKK1的转基因植株接种植物病原细菌烟草青枯病菌和病原菌棉立枯（Rhizoctonia solani）后，转基因植株中的几种病原相关基因的表达量较野生型植株均有所降低，转基因植株显示了对病原菌的敏感性。以上结果表明，GhMKK1可能在多种生物胁迫反应中发挥一定作用，并且可能负调控生物胁迫抗性。
　　 综上所述，GhMKK1提高了转基因植株对非生物胁迫的抗性，表现出对生物胁迫的敏感性，这些结果为我们进一步了解A组MAPKK的生物学功能奠定了基础，同时也为GhMKK1的进一步研究提供了依据。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 MAPK级联信号途径

1．1．1 植物中MAPK级联途径的发现

1．1．2 植物MAPK级联途径的结构

1．1．3 植物MAPK级联途径的分类

1．2 植物中MAPKKs的生物学功能

1．2．1 MAPKKs与高盐、干旱信号传递

1．2．2 MAPKKs与植物病原信号传递

1．2．3 MAPKKs与活性氧

1．3 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 植物材料的培养与处理

2．1．3 菌株与质粒

2．1．4 酶与各种生化试剂

2．1．5 PCR引物

2．2 实验方法

2．2．1 植物总RNA的提取

2．2．2 RNA的纯化

2．2．3 cDNA第一条链的合成

2．2．4 cDNA的纯化和末端加尾反应(用于5'RACE)

2．2．5 植物基因组DNA的提取

2．2．6 目的片段的回收

2．2．7 目的片段与克隆载体连接

2．2．8 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化

2．2．9 大肠杆菌质粒DNA的提取

2．2．10 重组质粒的酶切鉴定

2．2．11 DNA序列测定

2．2．12 GhMKK1全长cDNA序列的获得

2．2．13 GhMKK1融全长基因组序列的获取

2．2．14 基因瞬时表达

2．2．15 植物表达载体的构建与转化

2．2．16 转基因烟草鉴定

2．2．17 转基因烟草生理活性分析

2．2．18 转基因本生烟抗病性分析

2．2．19 半定量RT-PCR分析

2．2．20 组织化学染色分析

2．2．21 数据库及网络资源

2．2．22 生物学软件

3 结果与分析

3．1 棉花GhMKK1基因的分离

3．1．1 棉花RNA的提取及反转录

3．1．2 GhMKK1中间片段的分离

3．1．3 GhMKK1 5'片段的分离

3．1．4 GhMKK1 3'片段的分离

3．1．5 GhMKK1全长cDNA的分离

3．2 GhMKK1的全长cDNA序列分析

3．2．1 GhMKK1的全长cDNA序列分析

3．2．2 GhMKK1蛋白序列分析

3．2．3 GhMKK1基因组序列分析

3．3 GhMKK1的亚细胞定位分析

3．4 GhMKK1基因的表达特性分析

3．5 GhMKK1超表达本生烟的获得及鉴定

3．5．1 GhMKK1超表达载体的构建及获得

3．5．2 GhMKK1超表达本生烟的鉴定

3．6 GhMKK1超表达植株对非生物胁迫的抗性分析

3．6．1 GhMKK1超表达植株对高盐的抗性分析

3．6．2 GhMKK1超表达植株对干旱的抗性分析

3．7 GhMKK1超表达植株的抗氧化分析

3．7．1 GhMKK1介导的转基因本生烟中活性氧的积累

3．7．2 GhMKK1超表达植株对活性氧的抗性分析

3．8 GhMKK1超表达植株对生物胁迫的抗性分析

3．8．1 GhMKK1超表达植株提高了植株对病原菌的敏感性

3．8．2 GhMKK1超表达对转基因植株中抗性相关基因的影响

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表主要论文情况

论文说明