棉花黄萎病菌落叶型菌系在山东的分布、毒素测定及生防细菌筛选

摘要

棉花黄萎病是山东棉花生产中最严重的病害，年发生面积700多万亩，常造成巨大的经济损失，直接影响我省的棉花生产。近年来，棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae.Kleb）的致病力发生了明显变化，特别是落叶型菌系在田间的广泛出现，对我省的棉花生产造成越来越严重的影响。因此，了解落叶型菌系的特点及其在山东的分布，对有效控制棉花黄萎病的发生及传播，具有十分重要的意义。本研究从山东德州、东营和泰安等地棉花黄萎病发生田采集病株样品，经分离纯化，获得202株分离物，经培养性状观察、特异性引物扩增及致病力分析，发现落叶型菌系在我省分布十分广泛。对部分菌株的产毒能力及致病力进行了分析，发现各菌株产毒能力有较大差异。从不同地区采集土壤样本，筛选、鉴定出对黄萎病菌有明显拮抗作用的细菌菌株8株，为进一步对棉花黄萎病的生物防治提供了菌株材料。具体研究结果如下：
　　⑴于棉花黄萎病盛发期，从山东德州、东营、泰安等地采集棉花黄萎病标本，采用组织分离法，获得202株分离物。
　　⑵对各菌株的培养特征观察表明，202株分离物中，201株为菌核型，菌落黑色、白色气生菌丝稀薄或浓密，产生大量微菌核;1株为菌丝型，菌落白色、菌丝棉絮状、无微菌核和黑色素产生。
　　⑶用大丽花轮枝菌（Verticillium dahliae）特异性引物DB19/DB22对202株分离物进行PCR扩增，发现所有分离物均可扩增出一条530bp左右的特异性条带，表明202株分离物均为V.dahliae。
　　⑷为分析落叶型菌系在山东的分布，分别用2对特异性引物(INTD2f/INTD2r和INTND2f/INTND2r)对202株分离物进行PCR扩增，结果发现，其中201个分离物都在INTD2f/INTD2r作用下扩增出一条460bp左右的特异性条带，表明这些菌株为落叶型菌系，占所有分离物的99.5％;仅有1株分离物（HLX5-1-1）在非落叶型引物INTND2f/INTND2r作用下扩增出一条800bp左右的条带，占所有分离物的0.5％。表明落叶型菌系在山东各棉区分布广泛。
　　⑸随机选取8株分离物对其产毒能力、毒素对棉花种子萌发和棉苗的致萎作用进行分析，结果发现菌株HDF4-3-1产毒能力最强，菌株3-5毒素产生量最小，表明不同菌株的产毒能力具有差异。用毒素处理棉花种子和幼苗，发现菌株HDF5-3-1的抑制率和致萎指数最高，非落叶型菌系HLX5-1-1最低，表明不同菌株的致病力存在差异。
　　⑹测定了8株生防细菌的拮抗效果，结果发现:菌株JK-14对黄萎病菌的抑菌半径最大，为24.0 mm，菌株A12抑菌半径最小，为11.0 mm。表明菌株之间的拮抗性存在差异。经16S rDNA鉴定，A12为吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia），将菌株X-11、JK-14、SF-19、SF-23初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus spp)，菌株JK-19、JK-28、JK-25初步鉴定为类芽孢杆菌属（Peanibacillus spp）。