山东小麦根茎部主要真菌病害病原的分离鉴定和分子检测

摘要

山东小麦根茎部主要真菌病害包括小麦纹枯病、小麦根腐病、小麦全蚀病，这三种真菌病害是威胁小麦生产的一类主要病害。三者均属于土传病害，病菌在麦田土壤中可进行多年累积，而且自小麦苗期一成株期均可以侵染发病。田间仅从引起的早期症状不易区分，造成在生产上难以有针对性的提出具体、有效的防治措施。明确山东小麦主要根茎部真菌病害的病原组成，并在此基础上建立其快速检测技术十分必要。本研究首先对采自山东主要小麦产区的根茎部表现明显发病症状的植株，进行病原菌的分离鉴定，并在温室内对不同病菌的致病性进行了测定，初步确定了山东小麦根茎部主要病害的病原菌组成;在此基础上，针对这几种主要病害的病原设计其特异性引物，以实现对这几种主要真菌病害在苗期进行快速的检测。主要研究结果如下：
　　⑴2012年和2013年自山东小麦主要产区采集发病植株样本共计140余份，采用常规组织分离法进行病原菌的分离，分离得到357株病原菌，其中小麦纹枯病菌136株，小麦根腐离蠕孢菌169株、小麦根腐镰孢菌52株。运用形态学并结合ITS和EF-1α序列分析法对病原进行了鉴定，鉴定结果为:小麦纹枯病菌为禾谷丝核菌Rhizoctoniacerealis，其属于AG-D融合群;小麦根腐离蠕孢菌为麦根腐平脐蠕孢（Bipolarissorokiniana），小麦根腐镰孢菌有尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum），层出镰孢菌（Fusarium proliferatum）和黄色镰孢菌（Fusarium culmorum），其中黄色镰孢菌在镰孢菌种所占比例最高。
　　⑵采用麦粒-土壤接种法，选择分离得到的麦根腐平脐蠕孢菌29株，尖孢镰孢菌2株，层出镰孢菌5株，黄色镰孢菌9株于小麦苗期进行根腐病的致病性测定，结果表明:供试的29株麦根腐平脐蠕孢，2株尖孢镰孢菌WF42和WF51，4株黄色镰孢菌WF5、WF19、WF24和WF25都表现出较高水平的致病力，其平均病情指数为30.67～46.67;黄色镰孢菌WF10和层出镰孢菌WF38的平均病情指数分别为18.00和16.67，致病力相对较弱;其余四株层出镰孢菌的平均病情指数为24.00～25.33，四株黄色镰孢菌平均病情指数约为19.33～28.67，具有中等致病力。致病力测定结果再次证明，麦根腐平脐蠕孢菌是小麦根腐病的优势致病菌。
　　⑶2013年采集的发病植株标本，一部分用于实验室进行病原菌的分离鉴定，另一部分利用CTAB法提取发病植株根茎部的总DNA，利用他人设计的针对不同病原菌的特异性引物对采自各地的代表性标本进行单引物的分子检测，结果表明:所有地区采集的样本中，小麦纹枯病症状明显的样本用常规组织分离法都分离到了纹枯病菌，利用分子检测的方法也都检测到了纹枯病菌的存在;同时表现根腐病症状明显的样本中，利用分子检测的方法也都检测到纹枯病菌的存在;根腐病症状明显的样本中有13地用常规组织分离法分离到根腐病菌，同时用分子检测的方法也检测到了根腐病菌的存在;还有一部分根腐病症状明显的样本，利用分子检测的方法却没有检测到根腐病菌的存在。在来自济宁且表现全蚀病症状的标本利用分子检测的方法检测到了全蚀病菌的存在，同时在德州禹城和菏泽巨野地区的未表现全蚀病症状标本中，利用分子检测的方法也检测到了全蚀病菌的存在。
　　⑷多重PCR体系的优化利用Primer5引物设计软件，基于麦根腐平脐蠕孢菌的5.8SrDNA-ITS区序列，设计一对特异性引物RBF-2/RBR-2，产物大小为417bp左右，对麦根腐平脐蠕孢菌特异性良好。对应于4种病原菌采用的四对引物分别为:针对麦根腐平脐蠕孢菌的引物为RBF-2/RBR-2;针对纹枯病菌的引物为WKF-8/WKR-8（由本实验室徐娜娜设计）;针对镰孢菌的引物为延伸因子EF-1α序列的通用引物EF-1H/EF-2T;针对全蚀病菌的引物为GgtF/GgtR（参考陆琼娴设计的引物）。建立了能同时检测麦根腐平脐蠕孢菌、镰孢菌、全蚀病菌的多重PCR体系，并对该体系进行PCR条件的优化，使得在同一体系中能同时检测这三种不同的病原菌，小麦纹枯病菌需要单独检测，要想同时检测这4种病原菌仅需要进行二次PCR就可以明确不同地点的样本其病原的种类。
　　⑸于2014年3月份从山东的泰安、德州、聊城、菏泽、淄博和滨州等14地采集小麦苗期样本，依据其发病症状的有无将各地的样本分为无发病症状和有较明显的发病症状两类，利用CTAB法提取小麦根茎部组织的总DNA，利用建立的PCR检测体系对采集的标本进行分子检测。结果显示，在14地的28个检测样本中，都检测到了小麦纹枯病菌的存在，有21个样本检测到了麦根腐平脐蠕孢菌的存在，麦根腐平脐蠕孢菌的检测率为75％，仅在泰安马庄未表现发病症状的植株中检测到了镰孢菌的存在。这一结果表明，山东小麦根茎部真菌病害以小麦纹枯病发病最为普遍，田间小麦根腐病和小麦纹枯病通常表现为混合侵染的现象。