卵母细胞老化的研究：体外保存条件的优化及miRNA的调控作用

摘要

哺乳动物卵母细胞排卵后如果没有及时受精便会发生老化，卵母细胞的排卵后老化严重影响胚胎发育能力及后代的适应性和寿命。人类辅助生殖技术中有时不可避免的会使用老化卵母细胞，如采用ICSI对体外受精失败的卵母细胞再次进行受精，因此有必要对卵母细胞短时间体外保存方案进行研究。miRNA参与多种细胞凋亡过程的调控，而卵母细胞在老化过程中会出现多种与细胞凋亡相关的现象，因此有必要研究miRNA、细胞凋亡与卵母细胞老化三者间的关系。
　　本实验通过在不同保存温度下向培养液中添加抗氧化物质——丙酮酸钠、生育酚及半胱氨/胱氨酸，检测不同保存时间后卵母细胞对激活刺激的敏感性、发育能力及氧化应激水平，以找到最优体外保存方案;通过基因芯片检测不同老化时间卵母细胞中miRNA的表达谱，从中筛选出差异表达的且可能与细胞凋亡相关的miRNA进行后续功能研究。
　　37℃下在含10.27 mM丙酮酸钠和10μM生育酚的HCZB培养液中保存9h、25℃下在含20.27 mM丙酮酸钠的HCZB培养液中保存30h、15℃下在含10.27 mM丙酮酸钠的HCZB培养液中保存96 h和5℃下在含10.27 mM丙酮酸钠的HCZB培养液中保存48 h能够有效抑制卵母细胞对激活刺激敏感性的升高。在上述培养液内添加半胱氨/胱氨酸后能够在37℃9 h、25℃30 h、15℃48 h和5℃24 h条件下维持卵母细胞受精后的发育能力，将由上述方案获得的囊胚进行胚胎移植，其妊娠结果与来自新鲜卵母细胞的胚胎无差异。由于15℃保存48 h后需先进行6h恢复培养再进行受精，因此卵母细胞排卵后老化最长能够抑制54 h。ROS和谷胱甘肽的检测表明卵母细胞体外保存会造成其氧化应激水平显著升高，能够降低氧化应激水平的保存方案即能抑制卵母细胞对激活刺激敏感性的升高，但只有既能降低氧化应激水平又能促进谷胱甘肽合成的保存方案才能维持卵母细胞的发育能力。
　　基因芯片共筛选出62种体内老化过程中表达量变化倍数大于2的miRNA，采用qRT-PCR验证了其中可能与细胞凋亡相关的miRNA，从中选取了miR-98将其类似物显微注射入新鲜卵母细胞后经体外老化培养，卵母细胞会发生自发激活和乙醇联合6-DMAP激活率升高的现象，且预测的miR-98靶mRNA——Caspase-3的表达量升高，钙离子储量显著降低。这表明miR-98可能通过激活Caspase-3表达，使其切割内质网上IP3受体引起钙通道开放，钙离子由内质网泄露至胞质内，造成卵母细胞自发激活、乙醇联合6-DMAP激活率升高以及钙储量的降低。但miR-98是直接促进Caspase-3 mRNA的翻译还是作用于Caspase-3上游分子从而引起Caspase-3表达上调目前尚不清楚，仍需进一步研究。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 老化卵母细胞形态学及细胞生物学改变

1．1．1 卵母细胞细胞质膜及透明带

1．1．2 皮质颗粒

1．1．3 第一极体

1．1．4 纺锤体

1．1．5 染色体

1．1．6 其他

1．2 卵母细胞老化的机理

1．2．1 卵丘细胞加速卵母细胞老化

1．2．2 MPF和MAPK调控卵母细胞老化

1．2．3 线粒体功能异常导致卵母细胞老化

1．2．4 异常Ca2+升高导致细胞凋亡

1．2．5 异常表观修饰

1．2．6 氧化应激

1．3 卵母细胞老化的抑制

1．3．1调控MPF和MAPK抑制卵母细胞老化

1．3．2 低温抑制卵母细胞老化

1．3．3 抗氧化物质抑制卵母细胞老化

1．4 miRNA的发现

1．5 miRNA的生物合成

1．5．1 转录

1．5．2 细胞核内加工

1．5．3 出核转运

1．5．4 细胞质内的加工

1．6 RNA诱导沉默复合体(RISC)

1．7 miRNA介导的基因沉默方式

1．8 miRNA的更新

1．9 miRNA在细胞内的功能

1．10 miRNA与细胞凋亡

1．11 本文的研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 主要试剂及配制

2．2 实验动物及超排处理

2．3 体内成熟卵母细胞的获取

2．4 COCs的体外老化处理

2．5 裸卵制备

2．6 卵母细胞乙醇联合6-DMAP孤雌激活

2．7 卵母细胞乙醇孤雌激活

2．8 SrCl2激活处理

2．9 卵母细胞激活的判定

2．10 体外受精

2．11 胚胎培养

2．12 胚胎移植

2．13 卵母细胞内活性氧物质的检测

2．14 卵母细胞内谷胱甘肽的检测

2．15 体内老化老母细胞miRNA检测样品的取样

2．16 miRNA基因芯片检测与数据分析

2．17 荧光定量PCR验证miRNA基因芯片结果

2．18 DOs的体外老化

2．19 卵母细胞显微注射miRNA mimic

2．20 Caspase-3免疫荧光染色及定量分析

2．21 卵母细胞内钙离子储量的检测

2．22 数据分析

2．23 实验设计

2．23．1 降低小鼠成熟卵母细胞氧化应激水平以延长其非冷冻保存时间

2．23．2 miRNA在小鼠成熟卵母细胞老化过程中的调控作用

3 结果与分析

3．1 不同温度下丙酮酸钠、α-tocopherol、半胱胺和胱氨酸对卵母细胞对激活刺激的敏感性升高的抑制作用

3．2 卵母细胞经不同保存方案保存后Sr2+激活孤雌发育能力

3．3 经不同保存方案保存后的卵母细胞体外受精后的体外及体内发育能力

3．4 新鲜卵母细胞经不同保存方案保存后细胞内活性氧物质(ROS)水平、总谷胱甘肽含量(GSX)和还原型谷胱甘肽／氧化型谷胱甘肽(GSH／GSSG)比值的检测

3．5 基因芯片检测所需样品的质量控制

3．6 体内老化不同时间的卵母细胞miRNA基因芯片检测

3．7 荧光定量PCR检测miRNA系统的建立

3．8 荧光定量PCR验证miRNA基因芯片结果

3．9 miR-98对卵母细胞体外老化过程中自发激活、碎裂及死亡的影响

3．10 miR-98对卵母细胞体外老化后孤雌激活率的影响

3．11 miR-98对卵母细胞体外老化过程中Caspase-3表达量的影响

3．12 miR-98对卵母细胞内钙离子储量的影响

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况