J亚群禽白血病病毒多表位蛋白质疫苗和DNA疫苗的构建及免疫效果评价

摘要

J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus Subgroup J，ALV-J)首次分离于上个世纪80年代的英国，是外源性ALV与宿主内源性序列EAV-HP的重组体。ALV-J感染后会导致高发病率、鸡体生长迟缓和肿瘤，给全世界的养殖业造成巨大的经济损失。尽管一些国家的种禽公司已经成功实现了种鸡群ALV-J的净化工作，但是由于ALV在养鸡业的广泛流行、我国养殖模式的多样化、规模参差不齐等特点，在我国地方种鸡群中进行ALV-J的净化工作还是一项巨大的挑战。J亚群禽白血病的高发病率和宿主范围的广泛性使其成为兽医工作者持续关注的焦点。疫苗免疫是一种划算可行的控制临床疾病的有效方式。ALV是一种主要通过垂直传播的疾病，在宿主体内容易引起免疫耐受而很难诱导特异性抗体的产生，给疫苗研究造成了很大的困难，目前尚无可用的ALV商品化疫苗。因此，研制一种有效、安全的疫苗来预防ALV-J的广泛流行迫在眉睫。研究表明，单一抗原的免疫原性较差且诱导的免疫保护有限。一种以表位为基础的包含病原体多个保护性抗原表位的多表位疫苗可以克服这些缺点。本研究中设计和构建了一个基于ALV-J NX0101毒株的嵌合多表位基因来制备相应的多表位疫苗，并评估了其在鸡体内的免疫效果及攻毒保护率，期望其诱导的免疫应答能抵抗ALV-J的感染，为探索ALV-J疫苗的研制提供方法和思路。
　　1、嵌合多表位基因的设计和构建
　　通过生物信息学软件及相关网站分析ALV-J中国典型毒株NX0101三个主要结构基因gag、pol和env所编码蛋白的B细胞和T细胞表位，根据亲水性、柔韧性、二级结构、表面可及性等选择标准，同时比较近几年ALV-J流行毒株的同源性，结合相关文献的研究报道，筛选出4段抗原表位集中且序列保守的区域Gag(278-376aa)，Pol(784-855aa)，Env(Gp85:145-156aa和Gp37:412-538aa)以柔性肽GAGS作为Linker，将筛选的4段抗原表位基因依次串联成一条全新的嵌合多表位基因X。分析表明，构建的嵌合多表位基因X有良好的亲水性、柔性及抗原性等，国内外未见报道，该研究丰富了ALV-J结构蛋白的生物信息学资料，为ALV-J嵌合多表位基因的原核表达及DNA疫苗的制备提供了基础材料。
　　2、嵌合多表位基因的原核表达和特异性检测
　　将构建的嵌合多表位基因X用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后克隆入表达载体PET-30a(+)进行原核表达研究。通过优化表达条件，确定了重组嵌合多表位蛋白X(rCMEPX)表达的最佳诱导温度为37℃，诱导时间为4h，IPTG浓度为0.5mM/mL。用临床ALV-J阳性血清和阴性血清进行Western-blots分析，结果证明rCMEPX表达成功并且能与临床ALV-J阳性血清发生特异性反应。间接ELISA实验评估了rCMEPX与临床ALV-J阳性血清反应的反应原性、特异性和敏感性。以纯化的rCMEPX为抗原包被酶标板，筛选出rCMEPX的最佳包被浓度为0.125μg/mL，抗体最佳稀释度为1:40，酶标二抗(HRP标记羊抗鸡IgG)的最佳稀释度为1∶5000，血清样品的阴阳性临界值为0.152，以上实验结果表明rCMEPX有良好的免疫反应性，为ALV-J蛋白质疫苗的研制奠定了基础。
　　3、嵌合多表位基因DNA疫苗的制备
　　将嵌合多表位基因X克隆入真核表达载体pVAX1来评估其作为DNA疫苗的潜力。重组质粒经酶切和测序鉴定真核表达质粒构建正确后，通过脂质体2000转染DF-1细胞，利用间接免疫荧光检测重组真核质粒在体外的表达。结果显示，转染了pVAX1-X的DF-1细胞胞浆呈现特异性的绿色荧光而转染了pVAX1质粒的细胞无绿色荧光出现，表明嵌合多表位基因能在真核细胞中得到表达。大量提取并纯化重组真核质粒为ALV-J嵌合多表位基因DNA疫苗的制备提供了试验材料。
　　4、嵌合多表位基因相关疫苗的制备及免疫效果评价
　　将构建的嵌合多表位基因X分别制备相应的蛋白质疫苗(rCMEPX)和DNA疫苗(pVAX-X)并评价了这两种疫苗在鸡体内的免疫效果和攻毒保护率。结果表明该嵌合多表位蛋白质疫苗(rCMEPX)和DNA疫苗(pVAX-X)均能诱导良好的体液免疫和细胞免疫反应，免疫鸡的攻毒保护率分别为80％和70％。用DNA疫苗初次免疫，蛋白质疫苗加强免疫的这种“prime-boost”策略，通过检测免疫鸡体液免疫和细胞免疫的各种指标，证明能有效增强该ALV-J DNA疫苗的免疫效果。本论文开展的ALV-J嵌合多表位基因相关疫苗的构建及免疫研究，为研制安全、高效的ALV-J疫苗提供了思路和基础材料。

目录

声明

论文说明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 禽白血病简介

1．1．1 ALV-J病毒的结构特征

1．1．2 流行病学

1．2 ALV-J的检测和诊断

1．2．1 病毒的分离和鉴定

1．2．2 血清学检测

1．2．3 聚合酶链式反应(PCR)技术

1．3 致肿瘤机制

1．4 ALV引起的免疫抑制

1．5 ALV-J的防治

1．6 疫苗研究

1．6．1 细胞表位

1．6．2 表位疫苗的研究进展

1．6．3 脂肽疫苗

1．6．4 复合多价表位肽疫苗

1．6．5 表位DNA疫苗

1．6．6 “prime-boost”免疫策略

1．6．7 CpG免疫佐剂的研究进展

1．6．8 前景展望

1．7 本研究的目的及意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 数据库、生物信息学软件

2．1．2 病毒和细胞

2．1．3 质粒载体和工程菌

2．1．4 工具酶

2．1．5 抗体及血清

2．1．6 主要试剂

2．1．7 主要耗材

2．1．8 仪器与设备

2．2 方法

2．2．1 主要试剂配制

2．2．2 ALV-J三个主要结构基因抗原表位集中区的预测筛选及嵌合基因的克隆

2．2．3 ALV-J嵌合多表位基因X的原核表达研究

2．2．4 嵌合多表位基因DNA疫苗的制备

2．2．5 嵌合基因X相关疫苗的免疫研究

3 结果

3．1 ALV-J嵌合多表位基因X的设计及克隆载体的构建

3．1．1 ALV-J三个主要结构基因编码蛋白抗原表位的预测结果

3．1．2 抗原表位集中基因片段的确定及获得

3．1．3 嵌合多表位基因X的构建

3．1．4 重组克隆质粒的鉴定

3．1．5 嵌合多表位基因X的结构特征分析

3．2 嵌合多表位基因X的原核表达研究

3．2．1 重组表达载体pET-30a(+)-X的鉴定

3．2．2 重组蛋白的SDS-PAGE及Western blots检测

3．2．3 原核表达条件的优化

3．2．4 重组蛋白检测特异性抗体的间接ELISA方法的建立

3．3 嵌合多表位基因DNA疫苗的制备

3．3．1 重组pVAX-X质粒的鉴定

3．3．2 重组真核质粒的大量提取和纯化

3．3．3 间接免疫荧光检测pVAX-X质粒的表达产物

3．4 疫苗免疫效果评估

3．4．1 各组免疫鸡的抗体水平

3．4．2 各组免疫鸡的外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞比率

3．4．3 间接免疫荧光实验检测抗血清与ALV-J的特异性结合

3．4．4 特异性中和抗体水平

3．4．5 ELISA法检测IFN-γ和IL-4细胞因子

3．4．6 病毒血症的检测结果

3．4．7 泄殖腔棉拭子p27抗原的检测结果

3．4．8 实验鸡病毒感染的检测结果

4 讨论

4．1 设计和构建嵌合多表位基因

4．2 原核表达嵌合多表位基因

4．3 真核表达嵌合多表位基因

4．4 嵌合多表位基因相关疫苗的免疫保护效果

5 结论

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的论文