NO对线粒体磷酸盐载体和线粒体膜通透性转换孔开放的调控作用

摘要

线粒体膜通透性转换孔（membrane permeability transition pore，MPTP）在线粒体控制的程序性死亡过程中起着至关重要的作用，对线粒体乃至细胞影响巨大。线粒体磷酸盐载体（phosphate carrier，PiC）作为MPTP的重要组成部分，被认为参与了MPTP的组成，但 PiC在线粒体通透性转换中所发挥的作用还不是很明确。一氧化氮（NO）是一种可以调节植物生理功能与代谢反应的生物活性小分子，它参与调节植物代谢和果实的成熟与衰老过程，并可调控线粒体功能，在植物体内具有不可替代的重要作用。目前对NO和线粒体之间作用的研究大多集中在NO与线粒体呼吸、线粒体蛋白氧化损伤等方面，对于采后果实细胞中线粒体MPTP开放的变化以及NO对线粒体MPTP开放的调控作用的研究鲜有报道。开展外源 NO对 PiC蛋白和MPTP影响的研究，有助于明确PiC蛋白在线粒体通透性转换过程中的作用，以及NO对线粒体MPTP开放的调控机理，对于明确MPTP开放机制，维持良好的果实品质，延长果实采后贮藏期具有重要的意义。
　　从肥城桃果实中提取RNA，根据GenBank中已经公布的其他植物的PiC的基因保守序列设计简并引物，通过降落PCR、RACE、巢氏PCR等方法，克隆得到肥城桃果实PiC基因cDNA全长共1769 bp，开放阅读框共有1116个碱基，编码372个氨基酸，在GenBank中的登录号为KP122948。疏水性预测PiC为疏水性蛋白；跨膜预测PiC为跨膜蛋白。氨基酸序列对比发现桃果实PiC蛋白与其他植物PiC蛋白的氨基酸序列同源性较高；系统进化树显示，桃果实PiC蛋白氨基酸序列与苹果、梅花的亲缘关系最近。将构建的表达质粒pET-30a-PiC导入大肠杆菌Transetta（DE3）进行诱导表达，蛋白质电泳显示在39 kDa处出现目的条带。使用镍柱对重组蛋白进行纯化，用梯度透析的方法将重组蛋白复性。荧光定量PCR结果表明，NO处理显著上调了贮藏期间PiC基因的表达。NO与PiC蛋白的荧光光谱显示，NO可与PiC蛋白发生反应，生成1:1的复合物。SPR方法进一步证明NO可使PiC蛋白发生巯基亚硝基化，且该修饰可逆。利用磷脂化合物人工构建了磷脂双分子层膜进行体外模拟MPTP功能，并对其组分进行了探究，发现当MO与DPPC比例为1:1，浓度0.1 mg·mL-1时效果最好。酵母菌双杂交实验证明PiC蛋白可以与CypD蛋白发生相互作用。

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1 前言

1.1 线粒体通透性转换孔与线粒体磷酸盐载体

1.2 NO与MPTP

1.3 人工磷脂双分子层膜

1.4 蛋白质间相互作用及酵母菌双杂交技术

1.5 研究内容及意义

2 材料与方法

2.1实验材料

2.2 实验方法

3.结果与分析

3.1 线粒体磷酸盐载体（PiC）全长cDNA的克隆

3.2 PiC序列分析

3.3 PiC重组蛋白体外表达与纯化

3.4 一氧化氮对PiC基因表达及蛋白质结构的影响

3.5 重组磷脂双分子膜模拟MPTP功能

3.6 酵母菌双杂交法检测PiC与CypD蛋白质相互作用

4 讨论

4.1 桃果实PiC基因的克隆及生物学分析

4.2 PiC重组蛋白的表达、纯化和复性

4.3 NO对PiC基因表达及蛋白的影响

4.4 人工磷脂双分子层体外模拟MPTP

4.5 PiC蛋白与CypD的相互作用

5 结论

6 创新之处

参考文献

致谢

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