山东省贝类弧菌病流行病学调查及副溶血弧菌快速检测方法的建立

摘要

山东省贝类资源丰富，养殖面积广阔，约占海水养殖面积的66％，年产量约占全省海水养殖总产量的80%，居各类水产品首位。近几年来，伴随着沿海经济的高速发展，环境污染问题越来越严重，生态养殖系统遭到了严重破坏，微生物病害也日趋泛滥，某些地区养殖贝类出现了严重的死亡现象，生态养殖生产受到了严重的阻碍。每年夏季的7-8月份是养殖贝类微生物病害流行爆发的季节，其中弧菌(Vibrio)是养殖贝类中的主要病原菌之一。因此，了解山东省主要经济贝类中弧菌的流行情况，并建立简便、快速检测方法显得尤为重要。
　　通过对山东沿海各养殖海区及相邻地区的主要养殖经济贝类养殖地区进行调查，发现了大量贝类死亡的现象。本试验采集了潍坊的羊口，东营的垦利、刁口、广利，烟台的招远、莱州以及日照、青岛、威海等地方的主要养殖经济贝类及野生贝类。通过细菌分离、生化鉴定、16SrDNA的克隆以及序列分析。结果：共采集各地样品的68份，其中主要养殖经济贝类44份、野生贝类24份；从样品中共分离细菌151株，可分为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等，弧菌分离率高达96%；弧菌中哈氏弧菌的分离率最高为24%，其次是溶藻弧菌为21%；哈氏弧菌和副溶血性弧菌采样分离主要在东营、烟台等地，溶藻弧菌主要在青岛、威海等地；另外，哈氏弧菌主要分离自扇贝、花蛤、毛蚶等品种，副溶血弧菌主要分离自花蛤、毛蚶中，溶藻弧菌主要分离自魁蚶、牡蛎中，其中哈氏弧菌在各贝类中较为普遍。
　　试验结果表明：哈氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌是山东省经济贝类弧菌病的主要病原菌之一，对扇贝(Scallop)、牡蛎(Ostrea gigas thunberg)、毛蚶(Scapharca subcrenata)、魁蚶(Scapharca broughtonii)、花蛤(Ruditapes philippinarum)危害严重；弧菌病主要发生在7-8月份的高温季节，这与细菌的最适生长温度一致。
　　食品安全国家标准中规定了食品中副溶血性弧菌的检测方法，可见国家对其重视。试验主要目的是建立一种贝类副溶血性弧菌的快速检测方法，不仅保证了食品安全，也便于贝类副溶血性弧菌病的检测。试验对副溶血性弧菌的不耐热溶血毒素基因 tlh设计了三对特异性引物（内引物、外引物、环引物），根据环介导等温扩增技术（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）原理进行扩增。对20株副溶血性弧菌和20株其它弧菌进行了扩增，结果显示LAMP检测方法特异性很强，与普通PCR检测方法对照，也显示出很高灵敏性，达到88fg/LAMP，高出近100倍。因此，研究表明，LAMP检测方法灵敏度高、特异性强，并且耗时短（约1h）、操作简单，成为快速检测贝类副溶血弧菌的一种有效方法。

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1前言

1.1背景及目的

1.2弧菌病

1.2.1弧菌的形态特征

1.2.2贝类弧菌病的致病机理及症状

1.2.3弧菌病的危害

1.2.4弧菌病的生物防治

1.2.5弧菌病的研究进展

1.3贝类弧菌病检测方法研究现状

1.3.1直接培养方法

1.3.2免疫学检测方法

1.3.3分子生物学检测方法

1.4环介导等温扩增技术—LAMP

1.4.1 LAMP原理

1.4.2 引物设计

1.4.3 LAMP 反应体系

1.4.4 LAMP反应结果判断

1.4.5 LAMP反应特点

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1试验菌株

2.1.2试验仪器

2.1.3试验试剂

2.1.4试验所用溶液及其配制

2.2试验方法

2.2.1弧菌病的调查试验

2.2.2 LAMP检测方法的建立

3结果

3.1弧菌病调查的结果

3.1.1弧菌的鉴定结果

3.1.2序列分析结果

3.1.3上传序列结果

3.1.4统计数据结果

3.2LAMP检测方法的结果

3.2.1可视化结果

3.2.2 LAMP方法的普遍性与特异性结果

3.2.3LAMP方法的灵敏度结果

4讨论

5结论

参考文献

致谢

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