小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性机制及溴氰虫酰胺对小菜蛾生物学特性的影响

摘要

小菜蛾（Plutella xylostella L.）属鳞翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutella），是一种世界性害虫，对十字花科蔬菜危害严重。目前，国内外防治小菜蛾仍然以使用化学农药为主。但是，由于小菜蛾自身具有较强的繁殖力和环境适应力，以及杀虫剂不合理大量使用等因素，使得小菜蛾已对多种杀虫剂产生了较严重的抗性。邻甲酰氨基苯甲酰胺类杀虫剂是一类作用于鱼尼丁受体的新型杀虫剂，通过干扰钙离子的释放，从而扰乱昆虫正常的生理活动，导致昆虫取食停止，最终引起死亡。因其独特的作用机理和显著的杀虫效果，以及对有益节肢动物毒害作用小和环境安全等特点，是目前防治小菜蛾等鳞翅目害虫最受欢迎的药剂之一，但其抗性问题也很快凸显出来。因此，我们系统研究了小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性机理和抗性特征，以及溴氰虫酰胺对小菜蛾的亚致死效应，以期为该类药剂的科学使用提供指导。主要结果如下：
　　1.通过连续以浸叶法用氯虫苯甲酰胺筛选小菜蛾52代，获得抗性达48.2倍的抗氯虫苯甲酰胺品系。通过抗性发展规律发现，F1~F8抗性发展比较缓慢，随后抗性发展速度逐渐加快，但是并没有出现抗性突增的现象。抗性稳定性试验显示，小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性不稳定，将抗性品系在不接触药剂的情况下饲养6代后，抗性倍数下降至14.9倍。表明该抗性属易恢复性抗性。
　　2.交互抗性结果显示，抗氯虫苯甲酰胺小菜蛾品系对氟苯虫酰胺和溴氰虫酰胺分别产生了7.29和3.31倍的交互抗性；而对毒死蜱、高效氯氰菊酯、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、溴虫腈、多杀菌素、氟铃脲和虫酰肼则未产生交互抗性。因此可以使用这些药剂与氯虫苯甲酰胺交替轮换使用，以延缓抗性。
　　3.抗性遗传实验表明，将抗性品系和敏感品系进行正反交，测定氯虫苯甲酰胺对其后代的毒力指数，结果表明小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性是常染色体、不完全显性遗传。回交后代的LD-P线在死亡率为50％处没有明显的斜坡，说明小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性由多个基因控制；同时，适合性检测也进一步证明了以上结果。
　　4.采用组建生命表法分析小菜蛾抗性品系的相对适合度，结果表明抗氯虫苯甲酰胺品系的生物适合度仅为0.77，适合度相对较低。与敏感品系相比，抗性品系小菜蛾幼虫历期延长了约1.5d，蛹期也明显延长；卵孵化率、幼虫羽化率及单雌产卵量均显著降低；另外其内禀增长率和净增值率也均有所降低。这些结果均表明小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺品系的生长发育和繁殖较对照有退化现象。
　　5.通过比较敏抗品系小菜蛾酶活性发现，抗性品系小菜蛾细胞色素P450的活性明显高于敏感品系，约为敏感品系的4.26倍；而酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶两个代谢酶，以及过氧化物酶和过氧化氢酶两个保护酶的活性在两个品系之间并没有明显差异。酶抑制剂增效试验结果表明，加入PBO和氯虫苯甲酰胺混用，对小菜蛾的毒力明显增加，说明细胞色素P450在小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性形成中起了重要作用。采用荧光PCR的方法测定P450基因在转录水平上的差异，发现CYP6BF1V1在抗性品系中的表达量明显高于敏感品系，约为敏感品系的8.9倍，另外CYP6BG1和CYP6CV2表达量也有所升高，分别为敏感品系的3.5和3.2倍。因此我们推测这三个基因应该是导致小菜蛾对氯虫苯甲酰胺产生抗性的根本原因之一。
　　6.为研究小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的靶标抗性机制，本试验克隆了小菜蛾鱼尼丁受体基因（PxRyR）的全长，为15,643bp，开放阅读框为15,372bp，能够编码5,123个氨基酸。将PxRyR的氨基酸序列与其他20个物种的鱼尼丁受体进行比对分析，构建进化树。对氨基酸二级结构分析发现C末端存在5个跨膜区，能形成功能性的Ca2+通道。用MOTIF Search进一步分析其结构域，发现小菜蛾鱼尼丁受体包括RYR结构域、RIH结构域、三磷酸肌醇和鱼尼丁受体共同控制钙离子释放结构域、MIR结构域等。用DNAMAN对敏抗种群鱼尼丁受体氨基酸序列进行比对，没有发现氨基酸的突变。但是荧光定量结果显示，抗氯虫苯甲酰胺小菜蛾品系中鱼尼丁受体的转录水平是敏感品系的6.0倍，靶标受体的量变也是其产生抗性的重要原因。
　　7.用LC20和LC50浓度的溴氰虫酰胺处理小菜蛾48h后分别观察对亲代和F1代的影响。与对照相比，溴氰虫酰胺处理后小菜蛾亲代4龄幼虫的历期、蛹期明显延长，化蛹率和羽化率显著降低，并且与浓度呈正比；溴氰虫酰胺处理后的雌雄蛹重均小于对照组，但是两个浓度处理之间没有差异；另外，LC50处理能够明显降低小菜蛾的单雌产卵量，而LC20处理和对照之间并没有显著性差异；表明溴氰虫酰胺对小菜蛾的生长发育和繁殖表现出显著的不利性。但是对其F1代继续观察发现，除LC50溴氰虫酰胺处理后能够明显延长F1代的卵的历期外，其他一系列生物学指标均没有明显变化。