致羔羊腹泻奇异变形杆菌的分离鉴定及其ompA基因重组乳酸乳球菌口服疫苗研制

摘要

2015年春，山东滕州某规模化羊场新生羔羊出现严重的腹泻，并且部分羔羊死亡。对该羊场病死羔羊进行剖检后，共分离到四株细菌（分别命名为PM1、PM2、PM3、PM4）。对所分离的细菌进行形态特征、生化试验以及16S rDNA遗传分析，判定该四株菌均为奇异变形杆菌。16S rDNA系统发育及同源性分析显示：四株分离菌与其它11株（NCBI收录）奇异变形杆菌的同源性为99％以上，其中与中国Hμ株、马来西亚PPB3株以及印度BAB-199株位于一个分支上，且与中国的Hμ株的进化关系最近；四株分离菌之间的同源性为100%，判断为同一株菌。细菌生长曲线、药敏试验、毒力试验、毒素测定试验以及游散行为分析结果表明，该分离菌于14 h左右达到生长稳定期，且对环丙沙星、左氟沙星最为敏感；对小白鼠有强致病性，分离菌培养液的无菌滤液对小白鼠无毒性作用；在含0.5%琼脂的LB平板上迁徙速度最快，且在含琼脂1.5%和2.0%的LB平板上呈圆环样周期运动。该研究结果为羊奇异变形杆菌病的防控提供了基础。
　　本试验构建了含羊奇异变形杆菌外膜蛋白 A（ompA）编码基因的重组载体pNZ8149-ompA，并将其电转入乳酸乳球菌NZ3900中。利用Westen blot检测目的蛋白的表达，间接免疫荧光试验及流式细胞仪检测目的蛋白在乳酸乳球菌中的定位。将重组乳酸乳球菌灌胃BALB/c小鼠，分别于口服后的1、2、3、4、5、6、7 d之后取其十二指肠、空肠、回肠、盲肠的肠道冲洗液，通过平板菌落计数法检测肠道内的乳酸乳球菌定植情况。Western blot检测到目的蛋白于49kDa处出现特异性条带；间接免疫荧光试验检测到重组乳酸乳球菌菌体表面出现绿色荧光；流式细胞仪检测到重组乳酸乳球菌表面荧光强度明显强于空质粒对照组。重组乳酸乳球菌灌服小鼠后能在肠道黏膜的不同部位以一定比例存活，并于口服后6d达到定植高峰，7d后在十二指肠、空肠、回肠和盲肠定植率分别占第1 d的15.23%、24.19%、48.57%、40.07%。本试验表明羊奇异变形杆菌ompA能够稳定表达于乳酸乳球菌表面，且重组菌在小鼠肠道内具有良好的定植能力，定植规律为回肠>盲肠>空肠>十二指肠。这为研究乳酸乳球菌作为羊奇异变形杆菌口服疫苗及其对小鼠肠道免疫机理的影响提供试验基础。
　　以泰山松花粉多糖（TPPPS）作为口服疫苗佐剂，探究其对小鼠免疫功能作用的影响，结果表明，单纯的重组乳酸乳球菌口服疫苗能诱导特异性IgA和IgG、IL-2、IL-4和IFN-γ的产生，促进T淋巴细胞增殖，且免疫后小鼠可显著抵抗奇异变形杆菌于肠道内定植。此外，与单纯重组乳酸乳球菌口服疫苗相比，TPPPS佐剂可诱导更高水平的IgA、IgG、IL-2、IL-4和IFN-γ，以及T淋巴细胞增殖反应。综上所述，乳酸乳球菌联合TPPPS佐剂制备口服疫苗，提供了一种预防奇异变形杆菌感染的新型方法。

目录

声明

符号说明

1.引言

1.1奇异变形杆菌研究现状

1.2细菌鉴定方法

1.3乳酸菌及其表达系统的研究现状

1.4黏膜免疫疫苗的研究进展

1.5松花粉多糖研究进展

1.6 本研究的目的及意义

2.材料与方法

2.1材料

2.2羔羊奇异变形杆菌的分离与鉴定

2.3 奇异变形杆菌ompA基因重组乳酸乳球菌的构建

2.4 ompA基因在重组乳酸乳球菌中的表达

2.5 泰山松花粉多糖对重组羊奇异变形杆菌口服疫苗的免疫增强效果

3. 结果与分析

3.1 奇异变形杆菌的分离鉴定及迁徙行为分析

3.2表达奇异变形杆菌ompA基因重组乳酸乳球菌的构建

3.3泰山松花粉多糖对羊奇异变形杆菌口服疫苗的免疫增强作用

3.4免疫保护试验

4．讨论

5. 结论

参考文献

致谢

8.攻读学位期间发表论文情况

9.个人简介