鸭疫里默氏杆菌双重PCR方法的建立及50S L27转座子插入突变株的部分生物学特性分析

摘要

鸭疫里默氏杆菌感染（Riemerella anatipestifer infection）是目前危害养鸭业的主要疾病之一，主要感染鸭、鹅等多种禽类的接触性传染疾病，又称为鸭传染性浆膜炎。该病是由黄杆菌科里默氏杆菌属的鸭疫里默氏杆菌引起的，感染鸭会出现生长缓慢，消瘦，饲料转化率降低，肉品质下降，及高死亡率等症状，在养殖和疾病的治疗等方面给我国养鸭业带来巨大的经济损失。
　　目前确认的鸭疫里默氏杆菌的血清型至少有21个，公布在GenBank上的就有9株鸭疫里默氏杆菌的全基因序列。鸭疫里默氏杆菌的编码基因超过2000个，而目前已研究的只有其中的极少数。现阶段控制鸭疫里默氏杆菌病的主要方法是注射疫苗和抗菌性药物，而绝大部分鸭疫里默氏杆菌菌株对卡那霉素有抗药性，因此本研究通过构建鸭疫里默氏杆菌的转座子随机突变库，来筛选和鉴定鸭疫里默氏杆菌对卡那霉素耐药相关的基因。
　　试验一是根据鸭疫里默氏杆菌CH3株dnaB基因和16S rRNA的序列设计引物，构建了双重PCR检测方法。采用方阵法对双重PCR反应条件和反应体系进行优化改造，优化的反应退火温度为60℃。试验结果表明，该新型双重PCR技术能准确检验鸭疫里默氏杆菌，对检测的所有不同血清型鸭疫里默氏杆菌菌株均能扩增出364 bp和627 bp两条特异的目的片段，而对鸭致病性大肠杆菌、鸭源禽巴氏杆菌、肠炎沙门氏菌、黄杆菌等对照菌株的扩增结果均为阴性；该PCR方法对细菌HXb2基因组DNA和菌液的检测敏感性分别为17.33 ng/mL DNA和2.9×103 CFU/mL细菌。利用建立的双重PCR检测了鸭疫里默氏杆菌感染鸭的肝脏和脑组织中的鸭疫里默氏杆菌，结果显示该方法与细菌分离法符合率分别为100％（9/9）和77.8%(7/9)，表明本试验建立的双重PCR方法可用于检测肝脏组织中鸭疫里默氏杆菌。本研究建立的双重PCR方法既可以对分离的鸭疫里默氏杆菌疑似菌株进行快速检测和鉴定，也可以直接用于临床样品中鸭疫里默氏杆菌的检测。
　　试验二是鸭疫里默氏杆菌分离株的卡那霉素药敏试验。试验选取了贵州大学送检的17株鸭疫里默氏杆菌，进行双重PCR鉴定、血清学鉴定和药敏试验。结果表明，这些分别属于1、2、5和15型鸭疫里默氏杆菌；且所有分离自贵州大学不同血清型的鸭疫里默氏杆菌菌株都对卡那霉素耐受。此外，本实验室常用的鸭疫里默氏杆菌如CH3、HXb2、Yb2和WJ4等也均对卡那霉素耐受。
　　试验三是将鸭疫里默氏杆菌的Yb2株为受体菌，将质粒pEP4351转入大肠杆菌BW19851，构建得到BW19851（pEP4351）作为供体菌，通过结合转导的滤膜接合转移法技术将质粒pEP4351导入受体菌鸭疫里默氏杆菌Yb2株中，使转座子Tn4351随机插入鸭疫菌株的基因组中。由于Tn4351上有红霉素抗性基因和Yb2对多黏菌素耐药，通过微量肉汤稀释法测定鸭疫和大肠杆菌BW19851对红霉素和多黏菌素的最小抑菌浓度（MIC），以红霉素0.3μg/mL和多粘菌素125μg/mL进行阳性接合子的筛选。构建的随机突变库，通过卡那霉素抗性实验来对突变株进行筛选，初步寻找到鸭疫卡那霉素抗性减弱的突变株，对突变株的最小抑菌浓度进行检验，以确定突变株是否对卡那霉素失去耐药性或耐药明显减弱。对验证后的突变株结果观察，筛选到了卡那霉素耐药性明显减弱的突变株DK-2。采用基因组步移法扩增测定转座子的插入位点在核糖体50S的L27亚基。
　　PCR扩增野生株的50S L27基因ORF，连入大肠杆菌-鸭疫里默式杆菌穿梭表达载体pRES51，得到互补质粒pRES-50S-L27，然后通过接合转导的方法将互补质粒导入突变株DK-2中，通过红霉素和多黏菌素抗性筛选和PCR检测鉴定，得到了互补菌株cDK-2。然后测定野生株、突变株和互补株的生长曲线和药敏试验。结果表明，野生株、突变株及其基因互补株的生长曲线差异不大；但DK-2的MIC比野生株Yb2和cDK-2低8倍左右。回复株cDK-2和野生株Yb2的卡那霉素药敏片直径为0，对kana是耐受的；而突变株DK-2的卡那霉素药敏片直径为10mm，表现对kana有低度敏感。另外，与野生株Yb2和互补株cDK-2相比，突变株DK-2对新霉素和利福平等抗生素的敏感性也增加。
　　总之，本研究通过构建鸭疫里默氏杆菌Yb2株的Tn4351随机突变中，筛选到了与卡那霉素耐药性相关的基因50S L27。本研究对进一步研究鸭疫里默氏杆菌50S核糖体及50S L27亚基的功能等奠定了基础。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1鸭疫的研究

1.2细菌的耐药性研究

1.3基因盒-整合子系统

1.4细菌卡那霉素的耐药机制

1.5 50S核糖体蛋白质L27

2.1试验材料

2.2试验方法

3 结果与分析

3.1鸭疫里默氏杆菌16S rRNA和dnaB基因的双重PCR结果

3.2贵州大学鸭疫里默氏杆菌双重PCR、血清型鉴定和药敏试验结果

3.3 Yb2转座子随机插入卡那霉素耐药基因的筛选鉴定

3.4 突变株DK-2的回复株构建结果

4 讨论

4.1鸭疫里默氏杆菌16S rRNA和dnaB基因的双重PCR方法

4.2贵州大学鸭疫里默氏杆菌血清型鉴定和药敏试验

4.3 Yb2转座子随机插入卡那霉素耐药基因的筛选

5结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况