年龄和腹泻因素对波尔山羊肠道菌群的影响及肠道益生菌的筛选

摘要

动物肠道菌群在促进机体的营养代谢、改善肠道微环境、刺激肠道粘膜免疫以及促进动物机体生长发育等方面发挥着巨大的作用。肠道正常菌群的失衡往往会激发各种各样的肠道疾病，继而引发动物腹泻、免疫功能降、生长指标下降等问题，给养殖业带来巨大的经济损失。波尔山羊作为一个优秀的肉用山羊品种，具有体型较大、生长速度快、产羔数量较多、屠宰率高等特点，在我国饲养规模不断扩大。但是肠道性疾病一直以来是制约羊产业发展的诟病，尤其是羔羊，由于其肠道菌群发育不完善以及免疫力低下等因素，肠道往往更容易被致病菌侵袭而引发腹泻等为主的肠道性疾病。肠道微生物在维持动物机体健康方面发挥着很大的作用，但是目前关于波尔山羊肠道菌群方面的研究较少，肠道菌群的组成及结构等了解不深。另外，随着国内外对食品安全要求的提高，以抗生素治疗为主的方法逐渐被其他方法所替代。微生态制剂具有高效无残留、无毒副作用等优点，近些年来逐渐成为肠道疾病的首选。但是目前还没有波尔山羊专用的微生态制剂，对其肠道菌群结构了解的也不够深入。因此，本试验通过高通量测序技术对波尔山羊肠道菌群结构进行分析，探索其肠道菌群随年龄增长以及腹泻影响下的变化规律。 通过Illumina MiSeq高通量测序技术对波尔山羊直肠样本中菌群组成、多样性、样本聚类和STAMP等方面进行了分析研究，结果表明年龄和腹泻因素作用下，肠道菌群的组成有一定的差异。其主要表现在年龄因素对肠道菌群的种类以及各菌群所占比例上有较大的影响，而腹泻因素对肠道菌群的影响主要表现在肠道优势菌群的组成及种类上。在门水平上分析，成年羊样品中 proteobacteria (变形菌门)、saccharibaacteria、fusobacteria (梭杆门)、tenericutes (软壁菌门) 较羔羊显示出较高的丰度，腹泻羔羊样品中firmicutes(厚壁菌门)、actinobacteria(放线菌门)、verrucomicrobia (疣微菌门) 较健康羔羊而言丰度较高。在科水平上分析，成年组与羔羊组比较可以看出，成年组肠道菌群的物种多样性更为丰富。除了Bacteroidales_S24-7_group、Succinivibrionaceae（琥珀酸弧菌科）出现在成年羊肠道中外，在菌群的比例上两组也存在差异，Rikenellaceae（理研菌科）、Bacteroidaceae、Lachnospiraceae （毛螺菌科）、Peptostreptococcacea 以及Fibrobacteraceae（纤维菌科）变化差异较为明显。虽然羔羊肠道内的菌群在种类以及结构上逐渐与成年羊类似，但是在各菌群间所占比例方面仍有差异，这可能是造成羔羊易于被肠道致病菌感染的原因。健康组与腹泻组相比较菌群间的差异较为明显，腹泻组中丰度较高的包括 Bacteroidales_s24-7__group、Lactobacillaceae （乳杆菌科）、clostridiaceae（梭菌科）、peptostreptococcaceae（消化链球菌）、enterobacteriaceae（肠杆菌科）。种水平上分析，成年羊与羔羊肠道菌群组成上差异不明显。而健康组与腹泻组 相 比 较 ， 腹 泻 组 中 Turicibacter_sp._H121 、 Bacteroides_uniformis 、Bacteroides_sp._3_1_13 、 Lactobacillus_amylovorus 、 Escherichia_coli 、Bacteroides_massiliensis、Corynebacterium_maris（棒状杆菌）的丰度都出现明显的升高现象。其中，Lactobacillus（乳酸菌）和 Escherichia_coli（大肠杆菌）两种细菌对肠道的健康状态起到很大的作用。因此推断腹泻因素通过改变肠道菌群结构，破坏肠道菌群间的平衡而使动物机体发病或加重腹泻程度。在α多样性分析方面，成年羊肠道菌群的物种多样性最高，健康羔羊组次之，腹泻组最低。在β多样性分析方面显示成年羊与健康羔羊肠道的微生物群落组成具有一定的相似性，腹泻羊与健康羔羊的微生物群落组成差异性明显。α多样性分析和β多样性分析结果与前面菌群分析结果相吻合。 根据高通量分析结果，对波尔山羊肠道中的正常菌群细菌进行分离鉴定，分离到的5 株细菌分别为植物乳杆菌、乳酸乳球菌、嗜热链球菌、地衣芽胞杆菌和类芽孢杆菌。然后对分离的菌株和实验室保存的干酪乳杆菌进行生长曲线、耐酸耐胆盐、抑制有害菌生长、肠道蠕动、体外细胞吸附等试验进一步筛选优势菌株，将优势菌株混合后制成微生态制剂，对腹泻小鼠进行微生态制剂干预试验，结果表明该微生态制剂可以有效地抑制或降低肠道致病菌对肠道黏膜的损害程度，并且可以抑制致病菌在肠道内的增殖。本研究我们通过高通量测序技术对波尔山羊肠道菌群在不同因素影响下的变化规律进行了初步研究，筛选出微生态制剂备选株4株，并对其益生特性及对腹泻的预防及治疗效果进行了相关试验。这些相关研究结果对诊断和治疗波尔山羊肠道疾病以及肠道微生态制剂的研制与开发提供了一定的数据及理论支持。

目录

声明

符 号 说 明

1 前言

1.1 肠道菌群的研究概述

1.2 肠道菌群研究方法概述

1.3 常用益生菌的种类以及作用机理

1.4 羊腹泻性疾病主要的致病菌

1.5 微生态制剂概述

1.6 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 菌株、细胞株与试验动物

2.2 试剂和仪器

2.3 年龄腹泻因素对波尔山羊肠道菌群的影响

2.4 波尔山羊肠道益生菌的分离鉴定

2.5 益生菌的筛选试验

2.6 微生态制剂的动物实验

3结果

3.1 波尔山羊肠道菌群的高通量测序

3.2波尔山羊羊肠道益生菌群的分离鉴定

3.3 微生态制剂的动物实验

4讨论

5结论

参考文献

致谢

硕士期间发表论文情况

个人简介