麦田杂草荠菜(Capsella bursa-pastoris)对苯磺隆抗性分子机制的研究

摘要

荠菜（Capsella bursa-pastoris(L.)Medik.）是我国小麦田主要阔叶杂草之一，广泛分布于西南地区、华东地区、华北地区和长江流域。苯磺隆（Tribenuron-methyl）属乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂，是我国长期用作防除麦田荠菜的主要药剂。但是由于大量、频繁使用，其在中国主要小麦产区对荠菜的防治效果已明显下降，部分地区甚至出现了防治失败的现象，严重危害小麦产量。本研究以采自河南省的28个荠菜种群为研究对象，针对麦田荠菜对苯磺隆的抗性，从抗性分布、抗性水平、靶标及非靶标抗性机理、交互抗性及抗性种群适合度代价等多方面研究，以期为科学合理防治麦田抗药性荠菜种群提供理论指导，从而延缓荠菜抗药性的发生，主要研究结果如下： 采用整株剂量反应曲线法测定了28个荠菜种群对苯磺隆的抗性水平，结果显示测定的28个种群对苯磺隆均产生了高水平的抗药性，抗性倍数（RI）在11.3~595.8之间，其中采自驻马店市的HN-13种群抗性水平最高。 对荠菜ALS保守区片段序列进行扩增和测序，结果表明苯磺隆抗性种群中共含有以下7种ALS靶标基因突变类型：Pro-197-His（CCT-CAT），Pro-197-Leu（CCT-CTT），Pro-197-Arg（CCT-CGT），Pro-197-Thr（CCT-ACT），Pro-197-Ser（CCT-TCT），Pro-197-Ala（CCT-GCT）和Trp-574-Leu（TGG-TTG）。 连接转化试验结果表明，荠菜中存在两条ALS基因，且两条ALS基因均可以发生突变，并通过Southern blot试验进行了验证。在种群HN-01中，两条ALS基因197位点同时发生了突变，其中ALS-1中发生Pro-197-Ser（CCT-TCT）取代，ALS-2中发生Pro-197-His（CCT-CAT）取代。 以β蛋白基因为内参基因，采用实时荧光定量PCR法测定了荠菜抗敏种群中两条ALS基因在转录水平的差异；施用苯磺隆前后抗敏种群中ALS基因表达量的变化；荠菜不同器官组织根、茎和叶中ALS基因的表达量差异。结果表明ALS-1和ALS-2基因在表达量上无明显差异，抗性种群中ALS基因的表达量明显高于敏感种群；使用苯磺隆后，抗性种群中ALS基因的表达量出现明显上升；荠菜叶组织中ALS基因的表达量明显高于根茎组织。 分别以BsiY I和Nco I为内切酶设计了dCAPS分子标记，用于检测荠菜ALS基因197和574位点的野生型荠菜种群，从而鉴定突变型抗性荠菜种群的存在。经验证，dCAPS分析结果准确可靠，与基因测序结果相一致。 靶标酶ALS离体活性测定结果表明，抗敏种群中ALS总催化活性基本一致。突变型抗性种群（HN-01，HN-02，HN-03，HN-04，HN-05，HN-06，HN-07，HN-08，HN-09，HN-11，HN-12，HN-13，HN-15，HN-18，HN-19，HN-22和HN-25）中ALS酶活对苯磺隆的敏感性较敏感种群显著降低，为敏感种群的23.45-55.97倍，非突变型抗性荠菜种群（HN-10，HN-14，HN-16，HN-17，HN-20，HN-21，HN-23，HN-24，HN-26，HN-27和HN-28）ALS酶活对苯磺隆的敏感性与敏感种群基本一致。 以马拉硫磷作为P450s酶抑制剂，研究了其对抗性种群HN-06苯磺隆抗性水平的影响。试验结果表明，马拉硫磷施用浓度为1000g a.i.ha-1，可导致抗性荠菜种群对苯磺隆的敏感性提高，相较于敏感种群，抗性种群苯磺隆GR50值下降25%。 采用整株测定法测定了HN-06及HN-13两个抗性种群对嘧草硫醚、双氟磺草胺、啶磺草胺、氟唑磺隆及咪唑乙烟酸等ALS抑制剂类除草剂的交互抗性谱。结果表明，测定的2个苯磺隆抗性种群HN-06和HN-13均对ALS抑制剂类除草剂嘧草硫醚，双氟磺草胺，啶磺草胺，氟唑磺隆产生了不同程度的高水平抗药性；HN-06种群对咪唑乙烟酸表现敏感，HN-13种群对咪唑乙烟酸表现出低水平抗性，抗性倍数分别为1.1和5.6。 抗性荠菜种群HN-05在光周期，温度，pH，盐胁迫，水势及埋藏深度等环境因素方面与敏感种群HN-00相比不存在适合度代价。试验结果表明，荠菜种子的萌发属于光周期不敏感类型；荠菜种子最适萌发温度为15-20℃；荠菜种子在pH=5-10范围内都有较高萌发率；荠菜种子的萌发对盐胁迫敏感性不高；荠菜种子的萌发对渗透势敏感；荠菜种子的出苗率在土壤表层时最高，随着埋藏深度的增加其出苗率逐渐减少，当埋藏深度超过1.2cm时，荠菜的出苗将完全被抑制。 本研究初步明确了我国河南省小麦田荠菜对苯磺隆的抗性分布情况及抗性水平。其中，双ALS基因拷贝存在于荠菜植株中，抗性种群中ALS基因的表达量升高及ALS酶基因突变导致的靶标酶敏感性降低，是导致荠菜对苯磺隆产生抗性的重要原因。P450s酶活性增强导致的对除草剂的代谢抗性也是抗性种群产生抗性的重要原因之一，且可与靶标抗性机制在一株荠菜中同时存在。荠菜抗性种群对ALS抑制剂类除草剂产生了不同程度的交互抗性。基于荠菜ALS基因序列分析，构建了快速检测荠菜ALS基因突变的dCAPS分析方法。此外，本研究初步测定了在不同环境因素下荠菜的萌发、出苗的特性。

目录

声明

1 前言

1.1 全球抗药性杂草的发生与发展概况

1.2 ALS抑制剂类除草剂的抗性发生

1.2.1植物的ALS与功能

1.2.2 ALS 抑制剂类除草剂

1.2.3 ALS抑制剂类除草剂作用机理

1.2.4 ALS 抑制剂类除草剂对作物选择性机理

1.2.5 抗 ALS 抑制剂类除草剂杂草的发生和发展

1.3 杂草抗药性的产生学说

1.4 杂草对除草剂的抗性机理

1.4.1 杂草对 ALS 抑制剂类除草剂的靶标抗性机理

1.4.2 杂草对ALS抑制剂类除草剂的非靶标抗药性机理

1.5抗性杂草的适合度

1.6 抗药性杂草的检测方法

1.7 本研究的目的与意义

1.8 技术路线

2 材料与方法

2.1 供试材料

2.1.1 荠菜种子的采集

2.1.2 供试杂草种子催芽及植株培养

2.2 荠菜对苯磺隆的抗性水平测定

2.2.2 供试药剂与施药方法

2.2.3 荠菜对苯磺隆的整株抗性水平测定

2.2.4 数据处理

2. 3荠菜对苯磺隆的抗性机理

2.3.1 靶标酶ALS基因差异性研究

2.3.2 ALS基因拷贝数的验证

2.3.3 ALS基因表达量差异的研究

2.3.4 dCAPS法分析ALS基因突变位点多态性

2.4 ALS离体酶活性测定

2.4.1 供试材料

2.4.2 供试试剂

2.4.3 仪器设备

2.4.4 ALS酶提取及活性测定

2.5 细胞色素P450单加氧酶（P450s）活性差异研究

2.6 不同荠菜种群对其他ALS抑制剂类除草剂的交互抗性

2.7 荠菜抗敏种群生物型萌发、出苗特性分析

2.7.1 供试材料

2.7.2 光照对种子萌发的影响

2.7.3 温度对种子萌发的影响

2.7.4 pH对种子萌发的影响

2.7.5 盐胁迫对种子萌发的影响

2.7.6 水势对种子萌发的影响

2.7.7 埋藏深度对种子出苗的影响

2.7.8 数据处理

3 结果与分析

3.1荠菜对苯磺隆的抗性水平

3. 2荠菜对苯磺隆的抗性机理

3.2.1 ALS基因片段序列差异分析

3.2.2Southern blot杂交试验对荠菜ALS基因拷贝数的验证

3.3 ALS基因表达量差异研究

3.3.1 RNA的纯度和完整性分析

3.3.2 内参基因与目的基因的融解曲线分析

3.3.3 荠菜抗敏种群ALS基因表达量差异

3.4 dCAPS分析荠菜ALS基因特定位点的单核苷酸多态性

3.4.1 荠菜ALS基因197位点dCAPS分析

3.4.2 荠菜ALS基因574位点dCAPS分析

3.5 ALS基因离体酶活性测定

3.5.1牛血清蛋白含量标准曲线

3.5.2乙偶姻（3-羟基-2丁酮）含量标准曲线

3.5.3 ALS离体活性测定

3.6 细胞色素P450单加氧化酶（P450s）活性差异

3.7 不同荠菜种群对其它除草剂的交互抗性谱

3.8 荠菜抗敏种群的萌发、出苗特性分析

3.8.1 光照对种子萌发的影响

3.8.2 温度对种子萌发的影响

3.8.3 pH对种子萌发的影响

3.8.4 盐胁迫对种子萌发的影响

3.8.5 水势对种子萌发的影响

3.8.6 埋藏深度对种子出苗的影响

4 讨论

4.1 荠菜对苯磺隆的抗性水平

4.2荠菜对苯磺隆的抗性机理

4.2.1荠菜对苯磺隆抗性的分子机理

4.2.2 荠菜ALS基因拷贝数的验证

4.2.3 荠菜ALS基因的表达

4.3 dCAPS法检测荠菜ALS靶标抗性突变

4.4 抗敏荠菜种群ALS离体酶活性差异

4.5 靶标突变与代谢增强在荠菜抗性植株中的共存现象

4.6 突变型ALS抑制剂类抗性荠菜种群的交互抗性谱

4.7 抗ALS抑制剂类除草剂荠菜种群的治理策略

5 结论

论文创新与有待研究之处

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况