MSERG4控制玉米与丛枝菌根真菌共生效率的功能探究

摘要

玉米(Zea mays L.)是全球种植面积最广、总产量最高的农作物之一.作为重要的粮食和工业原料,提高玉米的产量和质量对于解决全球粮食短缺、工业原料匮乏等问题具有重要意义.丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)是一种在土壤中广泛存在的内共生菌根真菌,超过80%的陆生植物与AMF共生后能够形成丛枝菌根(Arbuscular mycorrhiza,AM),这是植物与真菌进行物质交换的结构.植物为定殖的AMF提供脂质等营养物质,维持真菌的生长.根内共生结构与根外菌丝形成的强大菌丝网扩大了植物可以利用的土壤范围、调动土壤养分、提高植物对水分和矿质养分(特别是磷)的吸收利用、改善植物生长状态、提高植物对生物与非生物胁迫的抗性.共生效率是充分利用菌根资源对植物益处的基础.目前国内外对AMF与玉米共生之间的研究还局限在提高玉米抗逆性和促生效应等方面,而关于控制玉米与AMF共生效率相关基因的研究还尚未报道. 本课题组前期通过GWAS分析了380份玉米自交系与AMF的共生效率,发现不同自交系与AMF的共生效率存在差异,并且鉴定到玉米中的MSERG4基因与玉米自交系中的共生效率相关.亚细胞定位结果显示,MSERG4在内质网上表达.为了解析该基因影响共生效率的原因,我们选取高共生效率与低共生效率玉米自交系,比较在这两组自交系中MSERG4的差异.研究结果显示,MSERG4的转录水平在高共生自交系品种与低共生自交系品种之间没有显著的差异.而接种AMF能够促进根部MSERG4基因的转录.对高/低共生效率自交系中MSERG4基因的测序比对结果显示,该基因的编码区序列的差异不显著,并且不改变编码氨基酸的序列,而在3'UTR存在四种不同的差异类型,其中A型只存在于所测序的低共生效率玉米自交系中,B/C型存在于所测序的高共生效率玉米自交系,而D型在高共生效率、低共生效率和中等共生效率玉米自交系中都存在.这表明MSERG4影响玉米自交系共生效率的原因可能是由于3'UTR存在的差异. 为了探究MSERG4在玉米与AMF共生互作中的功能,我们对该基因的三个等位插入突变体进行研究,发现该基因负调控玉米与AMF之间的共生效率.在温室内对MSERG4基因三个突变体和野生型的茎粗、株高、地上部鲜重的统计结果显示,该基因的突变能促进玉米植株的生长,并且添加AMF之后能进一步促进其生长.对无机磷的测定结果显示,在叶部,突变体的无机磷含量高于野生型,而在根部,突变体的无机磷含量低于野生型.菌根特异性磷转运蛋白ZmPT6的表达量在突变体的根部显著上调.我们推测,MSERG4基因突变后,对玉米植株内无机磷的分配产生影响,促进了玉米根系无机磷向地上部的转运,使玉米根部呈现低磷状态,进而提高玉米与AMF的共生效率,通过菌根途径提高无机磷的吸收.另外,我们还发现,突变体与野生型玉米在混合种植时的共生效率显著低于单独种植时的共生效率,并且突变体在茎粗、株高、地上部鲜重这几个方面的性状在混合种植时也低于单独种植,可能是野生型玉米的根系分泌物影响了突变体的共生效率和生长状况,而MSERG4基因的突变影响这种物质的分泌,从而促进了玉米与丛枝菌根真菌的共生互作. 我们的研究首次发现了不同共生效率玉米自交系中MSERG4基因3'UTR存在差异,这些序列差异可能是导致其共生效率差异的原因,对后期深入解析该基因影响共生效率的机制提供了突破点.对基因突变体的研究发现,该基因突变后,对玉米植株内地上部与地下部无机磷的分配产生影响,这可能是MSERG4负调控玉米与AMF共生效率的原因.总之,我们的研究对深入挖掘菌根共生相关基因,研究控制菌根共生相关机理,培育高共生效率玉米品种具有一定的指导和借鉴作用.

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1 AMF简介

1.2 菌根共生相关基因

1.3 AM共生中的信号分子

1.4 丛枝的形成

1.5 AMF是脂肪酸异养生物

1.6 碳在菌根共生中的作用

1.7 AM共生与无机磷的吸收

1.8 AM共生与植物抗病性

1.9 植物对共生和免疫的调控机制

1.10 AM共生提高植物对非生物胁迫的抗性

1.10.1 AM共生与植物抗旱性

1.10.2 AM共生与植物抗盐性

1.10.3 AM共生与植物抗重金属性

1.11 依赖UTR的植物基因表达控制

1.12 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 植物材料

2.2 菌株

2.3 载体

2.4 实验方法

2.4.1 AMF的培养与孢子悬浮液的制备

2.4.2 玉米的温室盆栽种植

2.4.3 玉米突变体大田试验

2.4.4 检测玉米与AMF的共生效率

2.4.5 无机磷含量的测定

2.4.6 玉米总RNA的提取

2.4.7 基因表达量分析

2.4.8 MSERG4基因亚细胞定位载体的构建

2.4.9 玉米转基因载体的构建

2.4.10 融合Fluc的载体构建

2.4.11 农杆菌介导的烟草瞬时表达

2.4.12 MSERG4基因互作蛋白筛选

3 结果与分析

3.1 高低共生效率的玉米自交系中MSERG4基因的表达量

3.2 玉米自交系中MSERG4基因的SNPs分析

3.3玉米自交系中MSERG4基因3'UTR区的序列比对

3.4 构建MSERG4基因不同类型3'UTR的表达载体

3.5 MSERG4的亚细胞定位

3.6 酵母双杂筛选MSERG4的互作蛋白

3.7玉米突变体的研究

3.7.1 玉米MSERG4基因突变体的鉴定

3.7.2 AMF对温室玉米突变体的促生作用

3.7.3 AMF对无机磷吸收的影响

3.7.4 AMF对田间玉米突变体的促生作用

3.7.5 MSERG4对玉米抗病性的影响

3.7.6 菌根共生相关基因在mserg4中的表达水平

3.7.7 突变体与野生型混合种植对共生效率和生长的影响

4 讨论

4.1 非编码区对基因表达的影响

4.2 MSERG4基因在AMF与玉米共生效率和促生效果之间的作用

4.3 MSERG4基因在调节玉米与AMF共生和对纹枯病抗性之间的作用

4.4 MSERG4基因突变对玉米植株内无机磷的吸收与分配的影响

4.5 突变体与野生型混合种植与单独种植表型差异的原因

4.6 菌根资源在绿色农业中的应用前景

5 结论

参考文献

致谢

附录

附录Ⅰ 本实验所用到的玉米自交系编号、名称、以及共生效率

附录Ⅱ 本实验所用到的引物

附录Ⅲ 测序所用引物在MSERG4基因中的位置

附录Ⅳ 常规实验操作

1、DNA 片段回收

2、DNA 片段与载体的酶切反应

3、DNA 片段与载体的连接

4、转化大肠杆菌感受态DH5α

5、大肠杆菌质粒提取

6、EHA105转化过程

7、电击转化GV3101

附录Ⅴ 攻读学位期间论文发表情况