桔梗//大葱间作对桔梗根系及根际的调控研究

摘要

桔梗是常用大宗药材之一，具有重要的食用、药用和观赏价值，是药食同源植物。桔梗也是典型的忌连作植物，连作两年产量下降20%，连作五年以上，产量下降80%，甚至绝收。为缓解桔梗连作障碍，开展了桔梗与大葱间作研究。前期研究表明，间作大葱增加土壤速效氮、速效磷含量，提高了土壤碱性磷酸酶和多酚氧化酶活性和土壤细菌/真菌比。本实验进一步探究桔梗//大葱间作消减桔梗连作障碍的机理：应用GC-MS测定桔梗//大葱间作、桔梗单作、大葱单作根系分泌物；应用高通量Illumina Miseq技术分析桔梗//大葱间作、桔梗单作、大葱单作根际土壤微生物菌群结构；应用代谢组学实验技术研究并鉴定不同种植方式桔梗根部代谢差异。以期从桔梗根系生理代谢、根系分泌物和土壤微生物层面阐明桔梗//大葱间作消减桔梗连作障碍的机理。主要研究结果如下： 1.桔梗单作、大葱单作、桔梗//大葱间作种植时从桔梗、大葱根系分泌物中共鉴定出39种化合物，烃类18种、脂肪酸类3种、苯类4种、苯酚类2种、胺类3种、醇类2种、含硫化合物2种、杂环类化合物5种。在已鉴定的39种化合物中19种化合物是不同种植方式中桔梗根系分泌物中共有成分，其百分含量从高到低为[6-(1,1-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、N,N-二甲基十二酰胺、正三十六烷、2,4-3-甲基-1,2-二氢喹啉、2,4叔丁苯酚、15-Isobutyl-(13.alpha.H)-isocopalane（烷烃类化合物）、乙酸十八脂、二苄胺、棕榈酸甲酯、二十烷、β-谷固醇、十四烷、苯并噻唑、岩皂甾醇、三甲基十二烷、角鲨烯、2-甲硫基苯并噻唑、2,4-二甲基庚烷、十二甲基环六硅氧烷。间作大葱改变了桔梗根系分泌物种类和丰度。桔梗//大葱间作体系中桔梗根系分泌物中苯酚类、脂肪酸类、含硫化合物、胺类化合物丰度高于桔梗单作和大葱单作，而烷烃类化合物则低于桔梗单作、大葱单作。此外，桔梗//大葱间作还增加了桔梗根系分泌物总含量。与桔梗单作相比，在桔梗//大葱间作体系中桔梗根系分泌物中的苯并噻挫、2-甲硫基苯并噻唑、十二甲基环六硅氧烷和角鲨烯等有益化感物质含量显著提高，烷烃类化感抑制型化合物如三十六烷含量显著降低，降低桔梗根系分泌物的化感自毒作用。表明间大葱增加了桔梗根系有益化感物质的释放，有利于杀灭土壤病原菌，维护土壤微生态平衡。 2.Illumina MiSeq高通量测序获得的数据在97%相似性水平上进行分类，并对OTU的代表序列进行物种注释，桔梗单作、大葱单作、桔梗//大葱间作种植土壤的细菌共注释到45个门、659个属、1425个种，优势菌门分别是酸杆菌门、变形杆菌门、绿弯菌门、放线菌门，酸杆菌门为细菌中的第一优势菌群，占细菌总数的37.86%～56.85%之间。真菌共注释到11个门、344个属、552个种，子囊菌门是真菌第一优势菌门，相对丰度为85.50%～90.49%，担子菌门是第二优势菌群，占5.91%～7.30%。 与桔梗单作相比，桔梗//大葱间作增加了土壤中放线菌门丰度，提高了细菌/真菌比尤其是JC42和IJC32细菌比例明显升高，说明间作大葱改善了土壤微生态环境。桔梗//大葱间作增加了假单胞菌、硝化螺菌、拟杆菌等微生物比例，降低了赤霉菌的丰度。桔梗//大葱间作土壤细菌多样性高于大葱单作，低于桔梗单作。桔梗//大葱间作降低了真菌丰度，但提高了细菌/真菌比。表明桔梗//大葱间作优化了土壤微生物菌群结构。 3.桔梗//大葱间作显著改变桔梗代谢产物，其中IJC32差异代谢物种类最多，734种，下调代谢物685种，上调49种，IJC42差异代谢物612种，下调532种，上调80种，IJC52差异化合物362种，下调166种，上调196种。酪氨酸代谢、核黄素代谢、甲烷代谢、氨酰生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、泛素酮和其它萜类醌类化合物的生物合成、二苯乙烯，二芳基庚醇和姜辣素的生物合成、谷胱甘肽代谢、硫代谢、卟啉和叶绿素代谢、淀粉和蔗糖代谢、磷酸肌醇代谢、二萜生物合成、不饱和脂肪酸的生物合成、类黄酮生物合成、苯丙素的生物合成、氨酰生物合成是桔梗//大葱间作不同间作方式桔梗共有的差异代谢途径。 4.桔梗//大葱间作增加桔梗根SOD、POD、CAT活性，显著降低丙二醛含量，IJC32MDA含量最低，仅为2.1nmol/g，表明间作大葱有助于缓解桔梗连作对桔梗根系产生的逆境胁迫，桔梗//大葱间作是缓解桔梗连作障碍的有效间作模式。 5.桔梗单作产量为3351.15kg/hm2，间作显著提高了桔梗产量，IJC32产量最高为5319.19kg/hm2，比桔梗单作增产58.73%，IJC52产量为5216.62kg/hm2，间作大葱时桔梗增产效果显著；同时，种植方式影响桔梗分根数，IJC32、IJC42增加桔梗侧根数，IJC52降低桔梗测根数。在市场中，桔梗侧根少，价格高，综合产量和实际销售价格，IJC52为较好的间作方式。 6.桔梗药食兼用，可溶性糖是桔梗重要的食用指标，桔梗皂苷D、总酚、类黄酮是桔梗药用品质的衡量指标。桔梗//大葱间作显著提高桔梗可溶性糖含量，IJC32含量最高，470.23mg/g，IJC42次之，463.07mg/g，IJC52、SJG无显著差异。间作对桔梗皂苷D、总酚、类黄酮影响趋势基本一致，IJC32、IJC42间作模式降低了类黄酮和总酚含量，而IJC52桔梗类黄酮和总酚含量高于桔梗单作。间作大葱降低了桔梗皂苷D含量，但仍高于国家药典规定的标准。在3种间作模式中，桔梗皂苷D IJC52含量最高，8.47mg/g，但仍低于桔梗单作9.21mg/g。综合桔梗产量和品质指标，IJC52为较好的间作方式。 桔梗//大葱间作时大葱鲜产量比大葱单作加产12.89%～17.21%，其中IJC52大葱产量最高，IJC32最低。综合大葱产量、桔梗产量和品质，田间种植推荐采用五行桔梗两行大葱间作模式。 结论：桔梗//大葱间作增加了桔梗根系分泌物总量，提高了桔梗根系分泌物中杀菌物质苯并噻唑、2-甲硫基苯并噻唑、十二甲基环六硅氧烷和角鲨烯的含量，降低了化感自毒物质三十六烷含量。桔梗//大葱间作增加了土壤中放线菌门真菌的丰度和有益细菌假单胞菌、硝化螺菌、拟杆菌等细菌比例，降低了致病菌赤霉菌的丰度，改善土壤微生态平衡，有效消减因连作对桔梗根系产生的逆境胁迫，增加间作桔梗产量。间作大葱改变了桔梗根的代谢生理，影响桔梗品质。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1 药用植物连作障碍机理研究进展

1.1.1 药用植物连作对土壤理化性质的影响

1.1.2 药用植物连作对根系分泌物及化感物质的影响

1.1.3 药用植物连作对土壤微生物的影响

1.2 间作防治药用植物连作障碍的研究进展

1.2.1 间作对土壤理化性质的影响

1.2.2 间作对根系分泌物的影响

1.2.3 间作对土壤微生物的影响

1.3 药用植物代谢组学研究进展

1.3.1 药用植物代谢组学概况及意义

1.3.2 药用植物代谢组学研究方法

1.4 桔梗连作障碍研究进展

1.5 选题目的和意义

2 材料与方法

2.1 试验设计

2.2 取样

2.2.1 根际土及桔梗根取样

2.2.2 桔梗和葱产量测定取样

2.3 根系分泌物测定方法

2.3.1 仪器与试剂

2.3.2 根系分泌物提取

2.3.3 GC-MS分析

2.4 土壤微生物测定

2.4.1 仪器

2.4.2 实验方法

2.5 代谢组学分析

2.5.1 仪器

2.5.2 实验方法

2.6 桔梗根系氧化酶活性测定

2.7 桔梗产量及品质测定方法

2.8 数据分析

3 结果与分析

3.1 桔梗//大葱间作对桔梗和大葱根系分泌物的影响

3.1.1 桔梗//大葱间作的根系分泌物成分鉴定

3.1.2 桔梗//大葱间作方式根系分泌物相对含量

3.1.3 桔梗//大葱间作对分泌物总含量和典型化感物质含量的影响

3.2 桔梗//大葱间作对桔梗和大葱土壤微生物的影响

3.2.1对土壤细菌菌群的影响

3.2.2对土壤真菌菌群的影响

3.2.4对细菌真菌比的影响

3.3 桔梗//大葱间作对桔梗根代谢组学的影响

3.3.1 桔梗根部非靶标代谢组学分析

3.3.2 总离子流色谱图

3.3.3 PCA分析

3.3.4 PLS-DA分析

3.3.5正交-偏最小二乘判别分析

3.3.6总差异代谢物分析

3.3.7差异代谢物层次聚类分析

3.3.8 KEGG富集通路分析

3.3.9 共有代谢通路

3.4 桔梗//大葱间作对桔梗根系抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响

3.5 桔梗//大葱间作对桔梗产量和品质的影响

3.5.1 桔梗//大葱间作对桔梗品质的影响

3.5.2 桔梗//大葱间作对桔梗产量及产量构成因素的影响

3.6 桔梗//大葱间作对大葱产量的影响

4 讨论

4.1 桔梗//大葱间作对桔梗和大葱根系分泌物的影响

4.2 桔梗//大葱间作对桔梗和大葱土壤微生物的影响

4.3 桔梗//大葱间作对桔梗根代谢物的影响

4.4 桔梗//大葱间作对桔梗根抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响

4.5 桔梗//大葱间作对桔梗产量和品质及大葱产量的影响

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况