生防细菌与农药组合对苦瓜枯萎病的防治效果及机理研究

摘要

苦瓜枯萎病是一种为害苦瓜的土传病害，生产上主要通过施用化学农药防治该病害，但化学防治存在农药残留、抗药性及环境污染等问题。目前市场上销售的对西瓜、香蕉和甜瓜等枯萎病具有良好防效的农药及微生物制剂对苦瓜枯萎病的防治效果不是很理想，因此，研究一种安全有效的防治措施十分必要。本研究主要分为三方面：（1）以苦瓜枯萎病高发地土壤为模型，借助荧光定量PCR技术和Illumina Miseq高通量测序平台，以16S rDNA、ITS基因为标靶，定位研究施用化学熏蒸剂威百亩处理前后不同深度土壤中的枯萎病菌和土壤微生物数量、多样性、群落结构及土壤酶和pH值的垂直分布变化。（2）通过盆栽试验筛选出绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）G5菌株与杀菌剂恶霉灵（Hymexazol，Hym）复配施用最优组合，测定该组合对苦瓜叶片防御酶活性的影响。（3）研究在威百亩熏蒸区域施用生防菌G5与恶霉灵最优组合对苦瓜枯萎病的防治效果及土壤酶活性的影响。主要研究结果如下。 在苦瓜枯萎病高发地，5-40cm土层每克土壤中镰孢菌分生孢子的数量在103-104cfu，且随着土壤深度的增加逐渐降低；威百亩熏蒸后5-30cm土层镰孢菌的数量均下降，而对40cm土层镰孢菌数量无显著影响。熏蒸处理后5-30cm土层细菌16S rDNA基因拷贝数显著上升，在5cm达到最大值；5-30cm真菌ITS基因拷贝数较未熏蒸前显著降低，且各土层真菌基因拷贝数无显著差异，但都明显高于40cm土层。Beta多样性分析结果显示，威百亩熏蒸后，5cm、10cm土层真菌、细菌群落结构明显不同于熏蒸处理前，20cm以下土层真菌、细菌群落结构变化不明显；5-40cm土层pH升高；5-30cm土层土壤脲酶（S-UE）、蔗糖酶（S-SC）、过氧化氢酶（S-CAT）、酸性磷酸酶（S-CAP）的活性总体呈现显著下降趋势，而对40cm土层土壤酶活性无显著影响。 研究发现G5菌株能够在苦瓜体内及根际土中定殖。平板对峙试验表明，生防菌G5能够显著抑制苦瓜枯萎病菌菌丝的生长。不同稀释倍数的恶霉灵对苦瓜枯萎病菌菌丝生长及分生孢子萌发均有抑制作用，随着稀释倍数增大，抑制效果下降。G5菌株与农药恶霉灵室内相容性试验结果显示，标准使用浓度（稀释4000倍）下，恶霉灵对生防菌G5不仅没有抑制作用，反而能够促进土壤中G5的繁殖。 G5菌株与恶霉灵复配盆栽最适浓度筛选试验结果显示，B菌剂（1×109cfu/mL G5菌悬液）与不同浓度恶霉灵的组合对苦瓜枯萎病的防治效果高于A菌剂（1×108cfu/mL G5菌悬液）与恶霉灵各浓度的组合。B+0.75Hym（1×109cfu/mL G5菌悬液+恶霉灵标准使用浓度的75%）对苦瓜枯萎病的防病效果为81.60%高于其它各项处理，与对照相比该组合能够显著提高苦瓜幼苗茎粗、株高、叶面积、干重、鲜重。在枯萎病菌的胁迫下，B、Hym及B+0.75Hym处理均可诱导苦瓜叶片苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性的升高。两年的田间防病试验结果显示，B+0.75Hym对苦瓜枯萎病的防治效果高于单一施用B或Hym。表明盆栽试验筛选出的菌药组合B+0.75Hym，不仅能够更好的防治苦瓜枯萎病，而且降低了恶霉灵的使用量。 施用威百亩熏蒸处理后整个苦瓜生长周期内土壤脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶的活性均高于未熏蒸处理，45-60d未熏蒸处理三种土壤酶的活性均下降，而熏蒸处理三种土壤酶仍保持较高的活性。60d时威百亩熏蒸处理对苦瓜枯萎病的防治效果达到73.86%，威百亩熏蒸后施加B+0.75Hym组合对苦瓜枯萎病的防治效果为92.15%，有效地控制了苦瓜枯萎病的发生。 综上所述，在苦瓜枯萎病发病区施用威百亩熏蒸，并配合施用B+0.75Hym组合能够有效的降低苦瓜枯萎病的发病率，具有一定的生产实用价值。

目录

声明

1前言

1.1苦瓜枯萎病的研究进展

1.1.1苦瓜枯萎病的发生及危害

1.1.2瓜类枯萎病的致病机理

1.1.3苦瓜枯萎病的综合防治

1.2高通量测序研究进展

1.2.1高通量技术在土壤微生物分析中的应用

1.3生防假单胞菌的研究进展

1.3.1假单胞菌对植物的促生作用

1.3.2假单胞菌对病原菌的抗生作用

1.3.3假单胞菌对病原菌的竞争作用

1.3.4假单胞菌的定殖及竞争

1.4绿色荧光蛋白标记在微生物学中的应用

1.4.3绿色荧光蛋白在生防菌研究中的应用

1.5植物防御酶活性

1.5.1过氧化物酶

1.5.2苯丙氨酸解氨酶

1.5.3多酚氧化酶

1.5.4过氧化氢酶

1.6土壤酶研究进展

1.6.1土壤酶的来源

1.6.2土壤微生物与土壤酶的关系

1.7研究目的及意义

2材料与方法

2.1供试材料

2.1.1供试菌株及质粒

2.1.4供试培养基与栽培用土

2.1.5主要试剂

2.1.6主要仪器设备

2.2方法

2.2.1威百亩熏蒸对苦瓜枯萎病发病区土壤pH与酶活性及微生物的影响

2.2.2绿针假单胞菌G5菌株定殖研究

2.2.3恶霉灵对苦瓜枯萎病菌毒力测定

2.2.4生防菌G5与恶霉灵的相容性试验

2.2.5生防菌G5与恶霉灵复配对盆栽苦瓜最适浓度的筛选

2.2.6生防菌G5与恶霉灵复配最优组合对苦瓜幼苗防御酶活性的影响

2.2.7生防菌G5与恶霉灵复配最优组合对苦瓜枯萎病田间防效研究

2.2.8威百亩熏蒸+菌药最优组合对苦瓜枯萎病的田间防效试验

3结果与分析

3.1威百亩熏蒸对苦瓜枯萎病发病区土壤pH与酶活性及微生物的影响

3.1.1威百亩熏蒸对苦瓜枯萎病发病区土壤pH及酶活性的影响

3.1.2威百亩熏蒸对苦瓜枯萎病发病区土壤微生物群落结构的影响

3.2生防菌G5在植物体内的定殖研究

3.2.1阳性转化子的荧光检测

3.2.2标记菌株的PCR鉴定

3.2.3 GFPuv表达稳定性检测

3.2.4 G5与G5-GFPuv在苦瓜体内及根际土的定殖试验

3.2.5 G5-GFPuv在苦瓜根部定殖

3.2.6 G5与G5-GFPuv对苦瓜枯萎病的平板拮抗效果

3.3恶霉灵对苦瓜枯萎病菌毒力研究

3.3.1恶霉灵对苦瓜枯萎病菌菌丝生长的影响

3.3.2恶霉灵对苦瓜枯萎病病原菌孢子萌发的影响

3.4恶霉灵与生防菌G5相容性试验

3.5生防菌G5与恶霉灵复配对盆栽苦瓜最适促生防病浓度的筛选

3.5.1生防菌G5与恶霉灵复配对盆栽苦瓜最适促生浓度

3.5.2生防菌G5与恶霉灵复配对盆栽苦瓜最适防病浓度

3.6生防菌G5与恶霉灵复配最优组合对苦瓜幼苗防御酶活性的影响

3.6.1苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性变化

3.6.2过氧化物酶（POD）活性变化

3.6.3多酚氧化酶（PPO）活性变化

3.6.4过氧化氢酶（CAT）活性变化

3.7生防菌G5与恶霉灵复配最优组合对苦瓜枯萎病田间防效研究

3.8威百亩熏蒸+菌药组合对苦瓜枯萎病的田间防效试验

3.8.1威百亩熏蒸+菌药组合对苦瓜枯萎病防效研究

3.8.2威百亩熏蒸+菌药组合对田间条件下土壤酶活性的影响

4讨论

4.1威百亩熏蒸对苦瓜枯萎病发病区土壤pH与酶活性及微生物的影响

4.1.1威百亩熏蒸后不同深度土壤pH与酶活性分析

4.1.2威百亩熏蒸后不同深度土壤微生物群落结构分析

4.2菌药复配浓度的筛选及对防御酶活性的影响

4.2.1菌药复配浓度的筛选

4.2.2菌药组合对苦瓜防御酶活性的影响

4.2.3菌药组合苦瓜枯萎病田间防治效果研究

4.3威百亩+菌药组合对苦瓜枯萎病的田间防效及土壤酶活性的影响

4.3.2威百亩+菌药组合对田间土壤酶活性的影响

5结论

参考文献

致谢

8攻读硕士学位期间发表论文情况