荧光修饰双链DNA偶联单链DNA的三螺旋分子信标检测转Bt基因

摘要

当今世界，科技发展日新月异，科技的进步带动现代生物技术的大发展，其中转基因技术又被称之为人类历史上具有飞跃性进步的第二次“绿色革命”。转基因技术就是在作物原有基因的基础上引入外源基因，改造其遗传物质，使其营养价值、生物性状更好的满足人类的需要。利用转基因技术把苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis Bt）转入到小麦体内，目的主要是增加小麦的抗虫性，其中苏云金芽孢杆菌的δ-内毒素基因是小麦获得抗虫性能的最主要原因。但是转基因技术也存在一定的生物安全性问题，所以世界各国不断加强对转基因作物的监管力度与检测手段的研发。本论文应用标记荧光猝灭基团（BHQ-1）的单链DNA(triplex-forming oligonucleotides TFO)和两端同时标记荧光基团（FAM-6）的单链DNA（Single DNA S-DNA）构建三螺旋DNA分子信标，然后目标DNA单链(Target DNA T-DNA)和三螺旋DNA分子信标接触，导致三螺旋结构发生改变，从而引起荧光信号强度的改变，实现对转基因作物的灵敏检测。主要内容如下所示： 弱酸性环境下自组装三螺旋分子信标用于转基因作物中的目标基因苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis Bt）灵敏检测；最近几年，三螺旋分子信标被广泛用于转基因作物的灵敏检测，其中包括T·AσT和C+·GσC等三螺旋结构在内的分子信标是最为常用的。当三螺旋分子信标形成时，含有嘧啶链（胸腺嘧啶T和胞嘧啶C的）的单链DNA（triplex-forming oligonucleotides,TFO）需要在弱酸性环境下首先质子化后才能和双链DNA的嘌呤链(A和G）结合形成稳定的三螺旋分子信标，其中含有胞嘧啶C的DNA单链（TFO）质子化后，带正电的胞嘧啶C+与带负电的DNA双链由于静电作用，能够起到稳定三螺旋分子信标的作用。目标DNA单链加入后可以破坏三螺旋信标的结构，导致荧光强度的改变，实现对转基因作物的灵敏检测，检测下限达到1pM。 中性环境下自组装三螺旋分子信标用于转基因作物目标基因苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis Bt）灵敏检测；为了扩展三螺旋分子信标的应用范围，在本论文中人为加入Ag+用来增加三螺旋分子信标在中性环境下的稳定性。Ag+不仅能够特异性识别C·GσC的三螺旋结构，而且还可以把C+·GσC中的H+置换成Ag+C·GσC新的三螺旋结构，这样Ag+的加入就极大的增加三螺旋分子信标的应用范围。目标DNA单链加入后可以破坏三螺旋信标的结构，导致荧光强度的改变，实现对转基因作物的灵敏检测，检测下限达到0.1pM。

目录

声明

符号说明

前言

1.1转基因作物

1.1.1转基因作物发展状况

1.1.2转基因作物的优点

1.1.3转基因作物的潜在危害

1.2对转基因作物的检测

1.2.1 基于外源蛋白质水平的检测方法

1.2.2基于外源DNA的检测方法

1.3研究背景与研究内容

1.3.1 苏云金杆毒蛋白分类

1.3.2 苏云金芽孢杆菌转基因植物的发展情况

1.3.3 荧光探针法检测转Bt基因

1.3.4研究内容

2.实验部分

2.1仪器与试剂

2.1.1仪器

2.1.2试剂和DNA

2.2实验步骤

2.2.1 溶液的配制

2.2.2高压灭菌

2.2.3 三螺旋DNA的构建及与Bt基因的结合反应、荧光强度的测定

3结果与分析

3.1 弱酸性环境下三螺旋DNA对Bt基因的灵敏检测的可行性研究

3.1.1第一批的TFO构成三螺旋DNA后荧光强度的变化

3.1.2第二批的TFO构成三螺旋DNA后荧光强度的变化

3.1.3第三批的TFO构成三螺旋DNA后荧光强度的变化

3.1.4第四批的TFO构成三螺旋DNA后荧光强度的变化

3.1.5反应条件的优化

3.2 Ag+环境下三螺旋DNA对Bt基因的灵敏检测的可行性研究

3.2.1第一批的TFO构成三螺旋DNA后荧光强度的变化

3.2.2第二批的TFO构成三螺旋DNA后荧光强度的变化

3.2.3第三批的TFO构成三螺旋DNA后荧光强度的变化

3.2.4第四批的TFO构成三螺旋DNA后荧光强度的变化

3.2.5反应条件的优化

3.3 圆二色谱表征

3.3.1 弱酸性环境下的醋酸体系

3.3.2 Ag+环境下的PBS体系

4.结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况