转NtLTP4基因抗盐抗旱抗病马铃薯新材料的培育

摘要

马铃薯（Solanum tuberosum L.）是全球第四大粮食作物，仅次于小麦、稻谷和玉米。2015年，农业部将马铃薯主粮化工作列入重要议程。马铃薯在中国的种植范围很广，环境胁迫是限制马铃薯产量和品质进一步提高的主要瓶颈之一。马铃薯在受到环境胁迫后，会有不同程度的减产，严重的甚至减产70%左右。前期，从烟草中克隆得到一个编码非特异性脂转移蛋白的基因NtLTP4，研究表明，超表达NtLTP4基因能够增强烟草对非生物胁迫和生物胁迫的耐受性。在此基础上，本研究开展了NtLTP4基因转化马铃薯的研究，培育获得了抗盐碱、干旱和青枯病的马铃薯新种质，为马铃薯品种改良奠定了基础。主要的研究结果和结论如下： （1）ubi3启动子的克隆及表达活性分析 利用PCR技术，从马铃薯克隆了ubi3启动子，该启动子长度为921bp。将ubi3启动子插入pX6载体中，获得载体ubi3::pX6。进而，在载体ubi3::pX6中ubi3启动子的下游插入GFP基因，构建带GFP标签植物表达载体ubi3::pX6-GFP。用载体ubi3::pX6-GFP侵染烟草，2d后在上部叶片观察到荧光，说明ubi3具有启动子活性，可以启动下游基因的正常表达。 （2）NtLTP4基因过表达载体的构建及基因转化 设计含有适宜酶切位点的引物，PCR克隆NtLTP4基因，插入载体ubi3::pX6的ubi3启动子下游，获得了NtLTP4基因过表达载体ubi3::pX6-NtLTP4。将ubi3::pX6-NtLTP4载体导入农杆菌，利用农杆菌介导法转化马铃薯，共获得了18个株系。PCR检测结果显示，其中15株为NtLTP4阳性株系；进一步的qRT-PCR检测结果显示，株系L2、L9、L11、L12、L13中NtLTP4基因的表达量较高。对这5个株系进行Southern blot检测，结果显示5个株系都检测到了杂交信号，且信号条带数量1-4条，表明在这些转基因植株中至少存在1-4个拷贝NtLTP4基因；Western blot检测结果显示，5个株系都检测到了蛋白杂交信号，蛋白分子大小约为12KDa，表明这些转基因株系中NtLTP4基因都成功表达。 （3）NtLTP4过表达马铃薯株系的抗逆性鉴定 根据基因表达的检测结果，从NtLTP4过表达马铃薯株系中选取了NtLTP4表达量较高的3个株系（L11、L12、L13）进行盐胁迫、干旱胁迫以及侵染青枯菌，对其抗逆性进行检测。结果显示，转基因马铃薯株系在高盐环境下长势优于野生型马铃薯，而且NtLTP4表达量越高，马铃薯的耐盐性越强；转基因株系在干旱条件下的存活率高于野生型株系，且NtLTP4表达量越高，马铃薯的存活率越高，对干旱的耐受性效果越好；接种青枯菌的转基因株系发病率以及发病程度都低于野生型株系，且NtLTP4的表达量越高，马铃薯的青枯病发病率、发病程度越低，对青枯菌的抗性更强。上述结果表明过表达NtLTP4能够提高马铃薯对非生物胁迫（高盐、干旱）以及生物胁迫（青枯菌）的抗性，且该基因表达量越高，植物的对非生物和生物胁迫的耐受性越好。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1 环境胁迫对马铃薯生产的影响

1.2 马铃薯抗非生物和生物胁迫育种研究进展

1.3 非特异性脂转移蛋白的相关研究进展

1.3.1 非特异性脂转移蛋白的发现

1.3.2 非特异性脂转移蛋白的分类

1.3.2 非特异性脂转移蛋白的结构

1.3.3 非特异性脂转移蛋白的生物学功能

1.4 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 质粒和菌株

2.1.3 常用培养基、试剂以及实验仪器

2.1.4 PCR引物

2.2 试验方法

2.2.1 目的基因的扩增

2.2.2 DNA片段的回收（试剂盒法）

2.2.3 目的基因DNA片段与克隆载体的连接

2.2.4 大肠杆菌感受态制备

2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的转化

2.2.6 转化菌落PCR鉴定

2.2.7 质粒DNA的小量提取（试剂盒法）

2.2.8 质粒DNA的酶切

2.2.9 目的片段与质粒DNA的连接

2.2.10 根癌农杆菌感受态的制备

2.2.11 冻融法转化农杆菌

2.2.12 马铃薯ubi3启动子的克隆及表达活性分析

2.2.13 NtLTP4植物过表达载体的构建

2.2.14 农杆菌介导的马铃薯转化及转基因株系的获得

2.2.15 转基因植株的鉴定

2.2.16 转基因株系NtLTP4基因表达量的检测

2.2.17 转基因株系的Southern blot 分析

2.2.18 转基因马铃薯株系的Western blot检测

2.2.19 转基因马铃薯株系的非生物胁迫处理

2.2.20 转基因马铃薯株系的生物胁迫处理

2.2.21 组织化学染色方法

3 结果与分析

3.1 ubi3启动子的克隆与表达活性分析

3.1.1 ubi3启动子的克隆

3.1.2 ubi3启动子的表达活性分析

3.2 NtLTP4基因过表达载体的构建

3.2.1 烟草NtLTP4的扩增

3.2.2 NtLTP4植物过表达载体的构建

3.3 转NtLTP4基因马铃薯株系的获得与鉴定

3.3.1 转NtLTP4基因马铃薯株系的获得

3.3.2 转NtLTP4基因马铃薯株系的鉴定

3.4 NtLTP4的过表达增强了转基因马铃薯对非生物胁迫的抗性

3.4.1 转NtLTP4基因马铃薯株系对盐胁迫的抗性增强

3.4.2 过表达NtLTP4提高了马铃薯对干旱胁迫的耐受性

3.5 过表达NtLTP4提高了转基因马铃薯对青枯菌的抗性

4 讨论

5 结论

参考文献

附录1

附录2

附录3

致谢