协同共抑制分子TIGIT在人原发性肝癌中的表达调控及临床意义

摘要

目的（1）探讨TIGIT在人原发性肝癌患者组织和外周血中的表达及其临床意义;（2）为了进一步研究调控TIGIT的作用机制，构建miRNAs靶向TIGIT基因质粒pMIR-TIGIT-WT/mut，建立稳定过表达TIGIT的T细胞白血病细胞系（Jurkat T细胞）模型，探讨T细胞中调控TIGIT相关miRNAs的作用机制和临床意义。 方法 （1）免疫组织化学技术（IHC）和实时荧光定量PCR技术（qPCR）检测77例HCC患者组织中TIGIT、CD4、CD155的表达（癌组织73例，癌旁组织47例），用统计学方法分析其与临床病理特征的相关性； （2）流式细胞术检测31例HCC患者手术前后外周血CD4+T和Treg细胞中TIGIT的表达，分析其临床意义，30例健康体检者做阴性对照； （3）液相芯片技术检测血浆中炎性细胞因子在HCC患者中的临床意义； （4）根据TIGIT的核酸序列，通过miRBase和Targetscan等软件预测靶向作用TIGIT的miRNAs； （5） qPCR检测TIGIT相关miRNAs在HCC中的表达水平； （6）筛选出与TIGIT表达相关的miRNAs，根据其结合的靶点构建TIGIT3’-UTR野生型及突变型质粒重组体，利用双荧光素酶报告系统检测相关 miRNAs 与TIGIT 之间的靶向作用； （7）构建稳定过表达TIGIT的Jurkat T细胞株； （8） 将microRNA-up慢病毒载体，转染至过表达TIGIT的JurkatT细胞中，通过qPCR及WB检测TIGIT的mRNA及蛋白水平的变化； 结果 （1）IHC 结果通过平均光密度（IOD）及累计阳性面积值（AREA）进行统计分析，结果显示TIGIT蛋白表达于肝索间隙浸润的淋巴细胞上，TIGIT阳性细胞多分布于汇管区及血管周围，在肝索间隙也散在浸润。在肝癌组织中，随着肿瘤细胞分化程度由高到低，TIGIT表达逐渐增加；CD155蛋白主要表达于肝癌细胞的细胞膜上，部分细胞胞浆中也有表达，在高中分化期肝癌细胞中的表达量最高。 （2）qPCR结果显示，在癌组织中TIGIT、CD155mRNA明显高于癌旁组织中的相对表达量（P<0.05），在中分化期，TIGITmRNA表达水平最高；CD155 mRNA的表达水平在各分化程度没有明显的变化趋势； （3）流式细胞术检测结果显示，与健康对照相比，HCC 患者术前外周血 CD4+T淋巴细胞表面TIGIT表达显著升高（P=0.001），术后没有明显变化；HCC患者术前外周血Treg 细胞表面Tigit表达上调（P=0.02），术后表达下降，与健康对照相比无统计学差异。HCC 患者术前外周血 TIGIT+CD4+T 细胞频数与 AFP 呈正相关（r2=0.327，P=0.0015），HCC患者术前外周血TIGIT+Treg细胞频数与AFP呈正相关（r2=0.592，P=0.001）； （4）液相芯片技术检测血浆中炎性细胞因子在HCC患者术前及术后的分泌水平变化，与HCC患者术前炎性细胞因子的分泌水平相比，术后HCC患者血浆中促炎性细胞因子IL-17a表达升高（P=0.047），IL-6表达升高（P=0.043），抑炎性细胞因子IL-10表达减少（P=0.034）。 （5）通过生物信息网站预测TIGIT3'-UTR区与miR-206，miR-143，miR-203，miR-1，miR-425可能存在靶向关系，通过qPCR检测TIGIT相关miRNAs（mir-206、mir-143、mir-1、mir-203、mir-425）在HCC患者及正常对照组中的表达水平，结果显示：miR-206，miR-143在HCC患者中表达水平显著低于正常对照组，且与TIGIT+Treg细胞的频数呈负相关。提示miR-206，miR-143能够调控TIGIT在Treg细胞上的表达介导肿瘤的免疫逃逸； （6）成功构建了靶向miR-206的TIGIT重组质粒，通过双荧光素酶检测结果显示，过表达miR-206可抑制TIGIT重组载体荧光素酶的表达，抑制miR-206表达可使TIGIT重组载体荧光素酶的表达升高。实验结果证实了miR-206与TIGIT存在靶向关系； （7）成功构建过表达TIGIT Jurkat T细胞稳定株，感染microRNA-206-up慢病毒载体后，qPCR 及 WB 检测 TIGIT mRNA 及蛋白水平变化，与阴性对照组相比microRNA-206-up慢病毒载体感染组TIGITmRNA及蛋白水平降低。提示mir-206可以负向调控TIGIT的表达； 结论（1）TIGIT、CD155的mRNA和蛋白水平在癌组织中的表达明显高于癌旁组织，随着肿瘤细胞分化程度由高到低，在肝癌组织中TIGIT表达逐渐增加；TIGIT+CD4+T细胞,TIGIT+Treg细胞频数在HCC中明显增高，提示增加的功能紊乱的CD4+T细胞中TIGIT+Treg细胞是参与抗肿瘤免疫的重要亚群，这两类细胞频数与AFP均呈正相关关系，提示TIGIT有望成为HCC早期诊断和病情评估的潜在生物标志物；与HCC患者术前炎性细胞因子的分泌水平相比，术后HCC患者血浆中促炎性细胞因子IL-17a表达升高（P=0.047），IL-6表达升高（P=0.043），抑炎性细胞因子IL-10表达减少（P=0.034）。综上所述，TIGIT参与了肿瘤浸润性淋巴细胞免疫功能的调节，介导了肿瘤细胞的免疫逃逸机制，血浆中炎性细胞因子参与了原发性肝癌的发生、发展。 （2）TIGIT相关miRNAs（miR-206）在HCC患者外周血单个核细胞中表达水平显著低于正常对照组，且与TIGIT+Treg细胞的频数呈负相关；成功构建了靶向miR-206的TIGIT重组质粒，通过双荧光素酶报告系统验证了miR-206与TIGIT存在靶向关系；成功构建TIGIT过表达Jurkat T细胞稳定株，验证了mir-206可以负向调控TIGIT的表达。

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