一氧化氮在酒精抑制大鼠离体结肠运动中的介导作用及其机制研究

摘要

脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)后，受伤的神经组织发生出血、水肿、神经元变性、神经细胞凋亡等一系列进行性、自毁性的病理过程，即继发性脊髓损伤。继发性脊髓损伤的机制存在许多学说，如：微循环障碍学说、氧自由基与脂质过氧化学说、离子内环境学说、神经肽学说、神经营养障碍学说等，而炎症免疫反应学说作为继发性脊髓损伤的一种机制始终是人们研究和关注的热点。 脊髓损伤激发了剧烈的炎症免疫反应(Inflammation)，包括了残存的神经胶质细胞的活化，外源炎性细胞(中性粒细胞、单核细胞等)的侵入等。SCI后的炎症反应会导致瘢痕组织形成、神经细胞和少突胶质细胞的坏死和凋亡，从而阻碍损伤后神经功能的恢复。实验和临床SCI研究表明直接或间接地抑制SCI后炎症反应可减轻损伤后神经功能障碍。迄今为止，SCI后炎症反应发生发展的确切机制及其作用尚未完全清楚。进一步了解SCI后的炎症反应的病理生理机制，有益于研发有效的SCI防治措施和药物，从而促进SCI后神经结构和功能的修复。 银杏内酯B是银杏叶提取物的主要活性成分之一，是一类强特异性的血小板活化因子(PAF)拮抗剂。PAF是一种重要的磷脂类的炎性因子，具有促进多核白细胞聚集、趋化、黏附，激活单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞，产生各种细胞因子，增强血管通透性，扩大炎症反应等作用，还可通过促进血栓形成、降低脑血流量、加重脑水肿，影响神经细胞功能，参与脑血管疾病的发生发展过程。研究报告银杏内酯B通过抑制PAF功能而抑制缺血所导致的各类异常炎性反应及栓塞形成，抑制自由基的释出，从而保护脊髓组织免受损伤，因此银杏内酯B既能控制炎症又可促进神经再生。另外银杏叶提取物来源广泛且价格低廉，具有较大的实用价值。 本实验利用54只健康雄性成年Wistar大鼠，随机分为对照组、损伤组和GB治疗组。利用改良的Allen's重物坠落大鼠脊髓损伤模型。对照组仅行椎板切除术暴露硬脊膜而不损伤脊髓；损伤组分SCI后1d、3d、7d和14d四个时间段，切除椎板暴露且损伤脊髓；GB治疗组也分1d、3d、7d和14d四个时间段，在脊髓损伤后即刻按首次剂量2mg/Kg，腹腔注射GB，以后各时间段按2mg/Kg/d剂量分别持续给药。对实验动物进行主动脉灌流并制备石蜡切片，利用免疫组织化学SP染色法观察各组大鼠在脊髓损伤后1d、3d、7d和14d的损伤脊髓及其周围区星形胶质细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和少突胶质细胞的形态、分布及数量的变化。实验结果如下： 1．SCI后不同时间点损伤组和GB治疗组星形胶质细胞的变化 星形胶质细胞除了具有合成和分泌神经营养因子，支持和营养神经元，促进轴突再生以外，还会形成胶质瘢痕，阻碍再生轴突的重建。同时，星形胶质细胞还能够产生众多的趋化因子和细胞因子，从而参与到对神经系统疾病的免疫防御中去。本实验采用GFAP单克隆抗体SP免疫染色法特异地显示星形胶质细胞。结果发现：对照组GFAP阳性细胞均匀分布在脊髓灰质中，GFAP阳性星形胶质细胞呈现为星状，胞体上有少数的分支。在SCI后脊髓的损伤区主要表现细胞坏死，GFAP无表达。损伤组和GB治疗组脊髓损伤周围区与对照组相比，灰质部位GFAP表达都增强，表现为阳性细胞面积增大，数目增多。GB治疗组与损伤组相比，GFAP阳性细胞数和面积有显著性减小。SCI后ld时GB治疗组、损伤组和对照组损伤脊髓周围区GFAP平均阳性细胞数分别为27.16±1.72、28.17±1.47和19.33±1.75；SCI后3d时分别为31.83±1.94、35.33±1.75和19.00±2.12；SCI后7d时分别为30.50±1.05、34.50±1.76和19.80±1.09；SCI后14d时分别为29.83±1.7、33.17±1.60和19.40±1.51。治疗组、损伤组及对照组GFAP平均阳性细胞面积在SCI后ld时分别为23691.33±797.69、23826.50±449.82和21217.83±1278.87； SCI后3d时分别为24109.83±794.47、25424.67±439.95和20714.50±700.61；SCI后7d时为31412.83±947.33、33643.67±898.57和20610.83±445.78；SCI后14d为32414.17±834.47、36118.83±918.74和20617.83±422.66。以上数据显示，与对照组相比，损伤组和GB治疗组在SCI后1d、3d、7d和14d GFAP平均阳性细胞数和面积都有非常显著性增加(p<0.01)；而GB治疗组在SCI后3d、7d和14d GFAP平均阳性细胞数和阳性细胞面积较损伤组非常显著性减小(p<0.01)。提示SCI后应用GB可以有效地减少星形胶质细胞的增生和肥大。 2．SCI后不同时间点损伤组和GB治疗组小胶质细胞的变化小胶质细胞是CNS中常驻的巨噬细胞。研究发现，活化的小胶质细胞/巨噬细胞可能具有双重作用，一方面释放促炎性细胞因子，进一步导致组织损害；另一方面可产生多种神经存活和组织修复所需的生长因子，有益于损伤组织的修复。本实验采用EDl单克隆抗体SP免疫染色法特异地显示活化的小胶质细胞/巨噬细胞。结果发现：对照组大鼠脊髓EDl阳性细胞含量极少，细胞体积小、呈圆点和细长状态，染色较浅。在SCI后脊髓的损伤区主要表现为细胞坏死，EDl基本无表达。在损伤组和治疗组损伤脊髓周围区SCI后EDl平均阳性细胞数量增加、体积增大，并出现小突起(伪足)表现出活化巨噬细胞的形态特征。GB治疗组EDl平均阳性细胞数较损伤组非常显著性减少。GB治疗组和损伤组脊髓损伤周围区与对照组相比，EDl平均阳性细胞数在SCI后1d时分别为18.00±0.89、19.33±1.51、12.17±0.75；SCI后3d时分别为24.67±1.03、28.00±1.41、11.83±1.17：SCI后7d时分别为20.33±1.21、22.17±1.47、12.33±1.2l；SCI后14d时分别为17.33±1.37、19.33±1.03、12.67±1.21。以上数据显示，与对照组相比，损伤组和GB治疗组在SCI后1d、3d、7d和14d EDl平均阳性细胞数都非常显著性增加(p<0.01)；GB治疗组在SCI后3d、7d和14dEDl平均阳性细胞数较损伤组显著性减少(3d p<0.01；7d和14dp<0.05)。提示GB能减少巨噬细胞向损伤脊髓炎症反应区募集、减少小胶质细胞的活化，从而减轻炎症反应。 3．SCI后不同时间点损伤组和GB治疗组少突胶质细胞和髓鞘的变化 少突胶质细胞的主要功能是形成中枢神经纤维髓鞘，另外还具有类似星形胶质细胞摄取神经递质(如γ-氨基酸等)、参与损伤神经的吞噬活动，并能在其成熟和形成髓鞘过程中抑制神经元突起的再生。本实验采用MBP单克隆抗体SP免疫染色法特异地显示髓鞘。结果发现：由MBP抗体标记的髓鞘呈棕褐色。正常对照组脊髓白质内MBP染色强，呈规整网格样结构，高倍镜下可以见单根轴突周围的髓鞘纵断面为连续或不连续的条索状，而横断面为环形或半环形，轴索位于中心，形成同心圆结构。在SCI后1d、3d、7d和14d治疗组和损伤组周围区MBP阳性细胞与对照组相比着色都变浅，SCI后1d时治疗组、损伤组及对照组MBP平均阳性细胞面积分别为35406.83±587.68、31431.83±673.63、39455.00±524.88，SCI后3d时分别为32073.50±577.06、30132.00±777.70、39711.33±755.84，SCI后7d时分别为30313.83±714.89、29301.17±591.79、40162.83±822.78，SCI后14d时分别为29724.00±735.61、28293.33士645.63、39764.67±578.29。以上数据显示SCI后MBP平均阳性面积非常显著性地较对照组减小(p<0.01)，提示SCI后形成髓鞘的少突胶质细胞受到破坏。GB治疗后MBP阳性髓鞘面积非常显著性升高(p<0.01)，提示GB可在一定程度上防止损伤脊髓神经轴突脱髓鞘并具有促进髓鞘再生的作用。 4．SCI后不同时间点损伤组和GB治疗组S100β的变化 在哺乳动物的中枢神经组织中，S100蛋白(S100-protein)主要定位于胶质细胞，特别是星形胶质细胞和少突胶质细胞。CNS内活化的胶质细胞主要分泌S100β，它是S100蛋白家族中最具活性的成分，是介导胶质细胞和神经元之间相互作用的桥梁。本实验采用S100β单克隆抗体SP免疫染色法特异地显示S100β阳性细胞。结果发现：正常脊髓组织S100β阳性细胞数量较少，染色较浅。在SCI后脊髓的损伤区主要表现为细胞坏死，S100β基本无表达。在损伤组和治疗组脊髓损伤周围区SCI后S100β阳性细胞数量增加、体积增大。治疗组与损伤组相比，S100β阳性细胞数则明显减少。GB治疗组、损伤组脊髓损伤周围区与对照组S100β平均阳性细胞数在SCI后1d时分别为13.50±0.55、14.83±1.16、10.50±1.05；SCI后3d时分别为21.33±1.03、25.50±1.04、10.33±1.37；SCI后7d时分别为18.00±0.89、21.33±0.82、9.83±1.16；SCI后14d时分别为15.33±1.21、17.83±1.17、10.17±0.75。以上数据显示SCI后1d、3d、7d和14d S100β平均阳性细胞数非常显著性地较对照组增加(p<0.01)，GB治疗组SCI后3d、7d和14dS100β平均阳性细胞数较损伤组非常显著减少(p<0.01)，提示GB对SCI后胶质细胞有保护作用。 综上所述，本实验可得出如下结论：(1)实验性大鼠急性SCI后，在损伤脊髓可引起星形胶质细胞的增生、活化和增殖，EDl炎性吞噬细胞和小胶质细胞的活化，以及少突胶质细胞形成髓鞘的断裂和肿胀；(2)GB能有效地抑制星形胶质细胞的增生和肥大，减少胶质瘢痕的形成，减少损伤处巨噬细胞的积聚及小胶质细胞的活化；在一定程度上防止损伤轴突脱髓鞘的作用，从而发挥抗炎症及对神经胶质细胞的保护作用。这对于研发合理有效的防治急性脊髓损伤的临床措施和药物，促进损伤脊髓结构重建和功能恢复提供了理论依据和有效的方法，具有一定的理论意义和应用前景。

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