α肾上腺素受体激动剂、拮抗剂的标记及其初步应用研究

摘要

本论文主要分三部分：Ⅰ．前言。Ⅱ．α<,1>肾上腺素受体拮抗剂和激动剂的生物素化。Ⅲ．量子点标记α<,1>肾上腺素受体拮抗剂的应用。 Ⅰ．在论文的第一部分首先对单细胞研究意义进行了简单的介绍。其次重点对Ccl肾上腺素受体及其拮抗剂和激动剂进行了介绍。第三，对荧光探针进行了综述，包括绿色荧光蛋白、Alexa Fluor染料和量子点。第四，介绍了量子点标记配体，包括量子点标记配体的方法和生物素化衍生物的制备。 Ⅱ．本论文的第二部分对α<,1>肾上腺素受体拮抗剂、激动剂的生物素化进行了详细的研究，制备了5种全新的可以与链霉亲和素包裹的量子点连接的生物素化配体，为进一步研究活细胞中配体与α<,1>肾上腺素受体作用及其动态行为提供了有力工具。 第一部分是生物素化哌唑嗪的合成：哌嗪与48﹪HBr在室温下反应，然后将反应液升温至60℃，在lh内分批加入2-氯-4-氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉后开始回流4h得到2-(1-哌嗪)．4-氨基．6，7-二甲氧基喹唑啉，产率94.6﹪，再将所得产物与N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯以乙腈为溶剂，在室温下反应过夜得最终产物生物素化哌唑嗪，产率56.4﹪。目标产物经<'1>HNMR和<'13>CNMR确认结构。 第二部分是生物素化去氧肾上腺素的合成：如果生物素化去氧肾上腺素与量子点之间距离太近，当二者连接后，这可能会因为量子点表面与α<,1>肾上腺素受体之间存在空间位阻而影响去氧肾上腺素生物素衍生物的生物活性，所以我们合成过程中在衍生物与量子点之间增加了不同长度的连接臂。首先，去氧肾上腺素与乙二醇或一缩二乙二醇的磺酰化产物反应，所得产物在经氨解，最后与N一羟基琥珀酰亚胺生物素酯以乙腈为溶剂，在38℃下反应16h得目标产物，经‘HNMR和<'13>CNMR确认结构。 Ⅲ．本论文的第三部分用第二章所制备的生物素化哌唑嗪，选择链霉亲和素包裹的量子点结合全内反射荧光显微镜，对量子点标记的α<,1>肾上腺素受体拮抗剂的应用进行了初步研究，在单细胞水平定位了活的HEK293A细胞膜上的α<,1>肾上腺素受体。实验中我们对孵育温度，浓度，时间等多种因素进行了研究。确定了定位HEK293A细胞膜上的α<,1>肾上腺素受体的条件为：孵育时间：1h；孵育温度：37℃；prazosin-QDs浓度：5×10<'-10>mol/L。并且证明了prazosin-QD与α<,1>肾上腺素受体结合的特异性。

目录

原创性声明及关于学位论文使用授权的声明

符号说明

第一章前言

1.1单细胞研究

1.1.1单细胞研究意义

1.1.2单细胞的影像学研究

1.2 α1肾上腺素受体及其激动剂和拮抗剂

1.2.1 α1肾上腺素受体

1.2.2 a1肾上腺素受体激动剂和拮抗剂

1.3荧光探针

1.3.1绿色荧光蛋白

1.3.2 Alexa染料家族

1.3.3新型纳米荧光探针—量子点

1.4配体的量子点标记

1.4.1量子点标记配体的方法

1.4.2生物素化衍生物的制备

1.5展望

第二章α1肾上腺素受体拮抗剂和激动剂的生物素化

2.1引言

2.2实验准备

2.2.1试剂

2.2.2试剂预处理

2.2.3仪器

2.2.4产品确认

2.3实验部分

2.3.1 α1肾上腺素受体拮抗剂的生物素化

2.3.2 α1肾上腺素受体激动剂生物素化

2.4结果与讨论

2.4.1 a1肾上腺素受体拮抗剂生物素化结果和讨论

2.4.2 a1肾上腺素受体激动剂生物素化结果和讨论

2.5结论

第三章量子点标记α1肾上腺素受体拮抗剂的应用

3.1引言

3.1.1全内反射荧光显微术

3.1.2全内反射现象

3.1.3全内反射荧光显微镜

3.1.4全内反射荧光显微镜的应用

3.2实验部分

3.2.1试剂与仪器

3.2.2实验步骤

3.3结果与讨论

3.3.1 prazosin—QD与细胞的孵育条件选择

3.3.2 prazosin—QD与α1肾上腺素受体结合的特异性

3.3.3prazosin-biotin与QD—streptavidin结合的特异性

3.4结论

论文总结

附图

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文