酿酒酵母BY5419生产丙酮酸的定向进化及辅酶工程改造

摘要

丙酮酸是生物体内重要的代谢中间产物，参与机体糖类代谢、酯类代谢等，在细胞代谢过程中起着关键的枢纽性作用，联系着己糖二磷酸酯途径(HDP)与三羧酸循环(TCA)两大循环，许多代谢途径可以通过丙酮酸这一共同的中间产物而联系起来。日常中，丙酮酸及丙酮酸盐的用途极广，它是一类重要的有机化工中间体，可以用来合成多种化合物如氨基酸、维生素等；甚至可以用于生产杀菌剂、除草剂等；特别近年来人们发现，丙酮酸钙具有良好减肥效果，继而其研究也越来越热。丙酮酸的生产方法主要有化学合成法、生物催化法和生物发酵法。而常见的化学合成法，酶催化法合成具有原料难得、结构复杂、成本较高，不适于大规模生产，合成的丙酮酸酸多为外消旋混合物等缺点，因此利用微生物法合成丙酮酸酸成为发展趋势。
　　 酿酒酵母作为一种研究和应用最为广泛的真核微生物，发酵生产乙醇具有极好的优势。在厌氧条件和溢出代谢情况下，经糖酵解生成的丙酮酸几乎全部或大部分流向生产乙醇的支路，从而产生乙醇的积累；同时酵母细胞具有较高的耐受性，乙醇可以积累到较高浓度。通过合理利用产乙酵的代谢流向，将乙醇的代谢流引向丙酮酸的积累，为丙酮酸的生产提供了新的思路。利用酵母积累丙酮酸，首先要阻断乙醇支路的第一个作用基因丙酮酸脱羧酶基因（由PDCl/5/6编码），但是敲除DC l/5/6后，改变了细胞内的代谢网络，导致细胞不能正常生长，主要表现为：(i)缺陷型菌株在葡萄糖限制的恒化条件下，在基本培养基上生长时，需要添加少量的乙醇或乙酸等二碳底物才能生长；(ii)在葡萄糖存在的基本培养基上，分批培养时，即使添加二碳底物，PDC缺陷型酵母菌株也不能生长。这就极大限制了PDC缺陷型酵母菌株代谢产丙酮酸的可利用性。
　　 针对PDC缺陷型酵母菌株，本文利用微生物细胞对生长环境的适应性，酵母细胞通过自身的突变然后经过自然选择作用，积累突变从而适应环境的能力，通过在摇瓶中一开始添加葡萄糖的情况下，通过二碳底物梯度减少的连续驯化培养，后期通过逐步增加葡萄糖浓度提高菌株高糖耐受性，筛选到一株可以较为正常生长且积累丙酮酸的菌株BY5419-Ao，并进行初步发酵研究，确定了驯化菌株Ao的发酵条件，在优化发酵条件下，丙酮酸可以积累到66.4g/L，产率为0.55gPyr/g Glc。驯化菌株虽然能在正常培养条件下生长，但仍极为缓慢，因而发酵周期相对较长。
　　 为了解决驯化菌株生长缓慢导致的发酵周期长的问题，我们利用辅酶工程的手段进一步对BY5419-Ao进行了分子改造。酿酒酵母细胞内，微量辅酶因子的变化就可能同时影响细胞内多个反应，从而引起细胞整体代谢的变化。酵母细胞代谢从葡萄糖到丙酮酸的过程，是氧化还原不平衡的，多余的NADH需要在细胞质内重新氧化，但酿酒酵母细胞质内重新氧化NADH的能力十分有限。为缓解酿酒酵母细胞细胞质内的氧化还原压力，可以引入外源的辅酶因子转化蛋白，进行辅酶因子的调控。本研究通过在驯化菌株BY5419-Ao中表达外源性的辅酶调节基因：来源于L.lactis NZ9000的NADH水合氧化酶基因(noxE)和来源于E.coli JM109的转氢酶基因(udhA)，来改善驯化菌株的生长及产酸情况。考虑到辅酶调节的微量性，即辅酶浓度的细小变化就可能导致细胞整体代谢的变化，本文构建noxE和udhA的系列启动子（GPD/GPD2/ADH1/TEF）的相关质粒，并采用不同拷贝数的质粒，调控量表达noxE和udhA基因，分别引入酿酒酵母驯化菌株BY5419-Ao，然后进行发酵，检测辅酶调节的作用，获得了丙酮酸产量提高的酵母菌株：l AN-Ao(70.47g/L)，2TN-Ao(70.86g/L)，IGU-Ao(72.86 g/L)IG2U-Ao(74.83 g/L)。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

缩略词表(ABBREVIATION)

第一章 绪论

1 丙酮酸概述

1.1 丙酮酸简介

1.2 丙酮酸及其盐的应用

1.3 丙酮酸的生产

1.4 丙酮酸的检测

2 酿酒酵母代谢

2.1 酿酒酵母及菌种改良研究

2.2 酿酒酵母的葡萄糖代谢

2.3 酿酒酵母生产丙酮酸有效性分析

2.4 酿酒酵母驯化工程

2.5 酿酒酵母辅酶代谢及应用

3． 本论文的研究目的及意义

第二章 产丙酮酸菌株的驯化选育及发酵研究

2.1 导言

2.2 实验材料及仪器

2.2.1 菌株和质粒

2.2.2 常用生化试剂

2.2.3 培养基

2.2.4 分子生物学常用酶、试剂盒

2.2.5 所用溶液及缓冲液配置

2.2.6 实验仪器和设备

2.3 实验方法

2.3.1 菌种保藏方法

2.3.2 菌株驯化操作方法

2.3.3 驯化菌株的菌种验证

2.3.4 菌株驯化前后生长情况比较

2.3.5 驯化菌株初步发酵研究

2.4 结果与分析

2.4.1 驯化菌株的菌种验证

2.4.2 菌株驯化前后生长情况比较分析结果

2.4.3 驯化菌株不同培养及发酵检测

2.4.4 驯化菌株不同供氧条件的培养情况比较

2.4.5 驯化菌株发酵初始糖浓度影响

2.5 讨论

2.6 小结

第三章 辅酶工程研究对驯化菌株BY5419-Ao产酸影响

3.1 导言

3.2 实验材

3.2.1 菌株和质粒

3.2.2 酶和试剂盒

3.3 实验方法

3.3.1 质粒pRS41K-GPDt和pS42K-GPD构建

3.3.2 不同强度启动子质粒的构建

3.3.3 moxE、udhA基因系列质粒的构建

3.3.4 moxE、udhA基因转入酿酒酵母BY5419-A0

3.3.5 moxE、udhA基因对BY5419-A0产酸影响

3.4 结果与分析

3.4.1 相关质粒图谱

3.4.2 质粒构建过程琼脂糖凝胶电泳图

3.4.3 moxE/udhA相关质粒转化酿酒酵母验证

3.4.4 moxE相关酵母转化子发酵结果

3.4.5 udhA相关酵母转化发酵结果

3.5 讨论

3.6 小结

全文总结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文

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