兔实验性骨关节炎关节液及血液中IL-18和TNR-a的测定及腺相关病毒包装的重组共表达载体pSNAV2.0-HSV1-tk-IRES-hIL-1Ra的表达

摘要

研究目的：
　　 骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)也称退行性关节炎，是由于老年或其他原因如关节的先天性异常、关节畸形、创伤等原因导致关节软骨的非炎症性退行性变及关节边缘骨赘生成，临床上可产生关节疼痛、活动受限和关节畸形等症状，严重影响老年人的身体健康，是致残的重要原因。近些年来，伴随着OA发病机制的深入研究，逐渐认识到在OA的病理过程中炎症因子IL-1β，TNF-α是引起炎症，导致关节软骨破坏和软骨基质降解重要的因素。但至今OA的治疗效果和方便程度无法令人满意，自杀基因治疗为骨关节炎的治疗提供了一种新的方法。实验性兔膝关节骨关节炎的病理变化机制，可作为研究人膝关节损伤致骨关节炎的动物模型。本实验拟应用新西兰大白兔制作膝关节骨关节炎模型，并检测在骨关节炎病程进展过程中软骨的退变，滑膜的增生，炎症因子IL-1β，TNF-α的含量变化情况，炎症因子含量达到高峰的时间，且检测由腺相关病毒包装的自杀基因pSNAV2.0-HSV1-tk-IRES-hIL-1Ra系统体内感染滑膜的效率，基因表达的情况。该系统中自杀基因HSV1-tk/GCV系统有抑制滑膜细胞增殖的作用，且利用其“旁观者效应”杀灭远处未被转染的增殖滑膜细胞；hIL-1Ra基因的作用在于表达hIL-1Ra抑制或减少致炎因子IL-1的作用，延缓OA的进展。为下一步的基因治疗骨关节炎打下基础。
　　 材料与方法：
　　 ①取3-4月龄健康新西兰大白兔，3％戊巴比妥耳缘静脉麻醉(1ml/kg)，清晰暴露右后腿膝关节，用脱毛剂行右后腿膝关节脱毛，无菌手术操作，切断有后腿膝关节前交叉韧带，切除内侧半月板。术后注射青霉素80万单位/天，连续三天。
　　 ②分别于术后2周、4周、8周、12周打开相应组的模型膝关节，取滑膜，软骨，滑液，血液进行进一步实验。
　　 ③用HE染色法检测2周、4周、8周、12周造模术后不同时间段的滑膜增生程度，软骨退变情况。用ELISA法分别检测2周、4周、8周、12周血清和膝关节滑液中IL-1β，TNF-α的含量变化情况。
　　 ④重组共表达载体pSNAV2.0-HSV1-TK-IRES-hIL-1Ra由师兄刘青春惠赠；rAAV2/1-TK-IL-1α是由腺相关病毒作为载体包装pSNAV2.0-HSV1-tk-IRES-hIL-1Ra所得。将由腺相关病毒包装的自杀基因pSNAV2.0-HSV1-tk-IRES-hIL-1Ra系统稀释成浓度为1.45×1011v.g./ml，取1ml注入右后膝关节关节腔，4周后，处死动物，手术迅速切开相应动物的右后膝关节关节腔，取滑膜组织，软骨，关节液，血液作为实验标本，进行HE染色，番红O染色，ELISA等后续实验。
　　 ⑤用柱式总RNA快速提取试剂盒(RLT-离心柱型)提取滑膜标本中的RNA，加入引物行反转录生成cDNA，进而用实时定量PCR(RT-PCR)方法检测pSNAV2.0-HSV1-tk-IRES-hIL一1Ra在滑膜组织中的表达情况。
　　 结果：
　　 ①造模后2周：滑膜有充血，呈红色，有水肿；关节软骨股骨内髁颜色变暗，尚无缺损、破裂、脱落。造模后4周：滑膜水肿、充血、增生明显；软骨退变较明显，弹性降低，色泽灰暗。造模后8周：滑膜增生明显，伴充血水肿，质地较脆；软骨退变明显，色灰暗，无光，表面毛糙不平，软骨弹性降低。造模后12周：滑膜组织增生明显，伴充血水肿；软骨有明显退变，无光泽，颜色灰暗，股骨髁滑车部及远端软骨表面成毛糙状，磨损严重，关节面两侧有少许增生的骨赘突出。
　　 ②组织学切片结果：造模后2周，HE染色示滑膜上皮充血、水肿；软骨表层略不平整，软骨内细胞开始出现细胞簇聚现象。番红O染色示部分软骨细胞周围区域染色不均。造模后4周：HE染色示滑膜上皮增生、水肿，炎症细胞浸润，上皮下胶原纤维轻度增生；软骨细胞数量减少，分布不均，有簇聚现象。番红O染色可见软骨细胞排列不均，有簇集现象，软骨基质部分区域失染。造模后8周：HE染色示滑膜上皮增生明显，大量炎症细胞浸润，上皮下胶原纤维增生明显；软骨细胞坏死增多，大量细胞簇聚。番红O染色示：软骨基质染色浅，失染区域增大。造模后12周：HE染色示滑膜上皮细胞明显增生，炎症细胞浸润明显；大量软骨细胞坏死，软骨纤维化明显，有血管生成并侵袭潮线。番红O染色可见软骨基质中软骨陷窝数目增多，软骨细胞簇集明显，有一部分区域的软骨全层染色消失。
　　 ③兔膝关节骨性关节炎中，炎症因子IL-1β，TNF-α的含量变化有统计学意义。IL-1β的浓度在2周达到高峰，在4、8、12周时浓度有所下降，但仍高于对照组。TNF-α的浓度在4周以前明显升高，在8、12周时浓度有所下降，但仍高于对照组。
　　 ④腺相关病毒包装的自杀基因pSNAV2.0-HSV1-tk-IRES-hIL-1Ra系统rAAV2/1-TK-IL-1α注入关节腔内转染滑膜细胞，经RT-PCR检测，结果示能扩增出特异性条带，说明腺相关病毒载体rAAV2/1-TK-IL-1α关节腔内转染细胞可表达目的基因。
　　 结论：
　　 ①切断前交叉韧带，切除内侧半月板是一种方便可行的建立兔膝关节骨关节炎模型的方法。随着骨性关节炎的病情进展，滑膜组织的炎性增生和软骨组织的退行性改变逐渐加重。
　　 ②IL-1β的浓度在2周达到高峰，在4、8、12周时浓度有所下降，但仍高于对照组。TNF-α的浓度在4周以前明显升高，在8、12周时浓度有所下降，但仍高于对照组。
　　 ③把rAAV2/1-TK-IL-1α注入关节腔内转染细胞，经RT-PCR检测，结果示能扩增出特异性条带，说明腺相关病毒载体rAAV2/1-TK-IL-1α关节腔内转染细胞可表达目的基因。