恩度使肿瘤微血管正常化时间窗及与顺铂联合治疗卵巢癌荷瘤鼠的实验研究

摘要

背景与目的：抗血管生成治疗作为一种新的抗肿瘤治疗手段，与常规化疗联合能提高疗效。恩度(Endostar)是一种新型可溶性的重组人内皮抑素(rhEndostatin)，能选择性地抑制微血管内皮的增殖、迁徙、粘附和存活，在非小细胞肺癌中与化疗药物联合应用已取得一定疗效。已有研究表明抗血管生成药物可使微血管呈现短暂的正常化口。本实验通过对恩度治疗卵巢癌荷瘤鼠在不同时间肿瘤微血管发生的形态学变化进行动态观察，找到使肿瘤微血管正常化的时间窗，并根据该时间窗设计不同的与顺铂联合用药方案，以寻找最佳的联合用药方案。本实验分两部分：一、恩度使肿瘤微血管正常化时间窗的观察。二、顺铂与恩度联合用药时机对疗效的影响
　　 一、恩度使肿瘤微血管正常化时间窗的观察
　　 目的：通过观察恩度治疗后荷瘤鼠瘤组织微血管结构及瘤组织乏氧状况的动态变化，确立肿瘤微血管发生正常化的时间窗。
　　 方法：
　　 (一)传统方法建立卵巢癌细胞株SKOV3裸鼠移植瘤模型。
　　 (二)实验分组及药物干预：
　　 随机将50只形成皮下移植瘤的裸鼠分为10组，每组5只，其中5组每日向皮下注射恩度20mg/kg，1次注射量均为0.2 ml，分别于第2、4、6、8、10天各处死一组，另5组分别作为对照组，每日向皮下注射生理盐水0.2 ml，分别于第2、4、6、8、10天各处死一组。
　　 (三)检测指标及方法：
　　 1.α-SMA和Ⅳ型胶原的检测：行免疫组织化学染色，计数表达微血管。
　　 2.肿瘤乏氧的检测：行免疫组织化学染色。观察乏氧细胞分布及表达，采用半定量积分法判断表达强度。
　　 结果：
　　 1.α-SMA和Ⅳ型胶原检测：表达α-SMA和Ⅳ型胶原的微血管主要位于临近周围间质的瘤组织处，恩度给药第4和6天α-SMA表达与对照组比较明显升高，分别是15.3±5.2/mm2 VS4.3±2.1/mm2(t=4.3860，P=0.0023)16.4±4.6/mm2 V S6.6±2.4/mm2(t=4.2235，P=0.0029)，差异有统计学意义。第8、10天α-SMA表达量下降，与对照组相比差异无统计学意义
　　 Ⅳ型胶原的在微血管的表达变化与α-SMA基本一致，恩度给药第4和6天表达Ⅳ型胶原的微血管达峰值，与对照组相比差异有统计学意义，分别是14.7±4.3/mm2 VS6.7±5.1/mm2(t=2.6816，P=0.0279)；18.4±5.5/mm VS27.1±1.7/mm2(t=4.3892，P=0.0023)，此后Ⅳ型胶原表达量迅速下降，与对照组无明显差异。
　　 2.肿瘤乏氧的检测：肿瘤乏氧细胞集中于肿瘤坏死区周边，HIF-1α表达于肿瘤细胞内，在乏氧区呈现高表达，恩度给药第2天乏氧区肿瘤细胞HIF-1呈现高表达，第4、6天乏氧改善，HIF-1α呈低表达，第8、10天HIF-1表达强度逐渐升高，呈中等强度表达。
　　 结论：
　　 恩度治疗可使肿瘤微血管产生一个短暂的趋于正常化状态的时间窗，恩度治疗的第4-6天肿瘤的微血管趋于成熟，乏氧状态得到部分改善。
　　 二、顺铂与恩度联合用药时机对疗效的影响
　　 目的：根据实验一确立的恩度使肿瘤微血管正常化时间窗设计恩度与顺铂在不同时间段联合治疗方案，观察治疗效果，以寻找最佳的联合用药方案
　　 方法：
　　 (一)传统方法建立卵巢癌细胞株SKOV3裸鼠移植瘤模型
　　 (二)实验分组和给药方法：
　　 随机将30只形成皮下移植瘤的裸鼠分为6组，每组5只，(1)恩度组：每日皮下注射恩度，剂量为20mg/kg，连续治疗10天。(2)顺铂(DDP)组：腹腔内注射DDP，剂量为3mg/kg，每日注射1次，共注射3次；(3)恩度+顺铂(d1-3)：每日皮下注射恩度，剂量同前，应用10天，于第1-3日腹腔给药DDP，剂量同前(4)恩度+顺铂(d4-6)，每日皮下注射恩度，剂量同前，应用10天，于第4-6日腹腔给药DDP，剂量同前。(5)恩度+顺铂(d7-9)：恩度用法同前，顺铂于第7-9天腹腔应用，剂量同前。(6)对照组：同法注射等体积生理盐水。第15天处死小鼠取瘤组织。
　　 (三)观察指标：
　　 1.绘制肿瘤生长曲线，计算抑瘤率。
　　 2.瘤体微血管密度(MVD)的观察：对CD34进行血管内皮细胞免疫组化染色，计算微血管密度(MVD)。
　　 3.肿瘤细胞凋亡标志物肿瘤细胞增殖核抗原(PCNA)检测：免疫组化法染色，采用半定量积分法判断表达强度
　　 结果：
　　 1.肿瘤生长曲线：对照组，顺铂单药及恩度单药治疗组，恩度+顺铂(d1-3)组瘤体增长速度较快，实验结束时肿瘤体积无明显差异。恩度+DDP(d4-6)及恩度+DDP(d7-9)组肿瘤增长延缓，试验结束时肿瘤体积与对照组及其余处理组差异有统计学意义(P<0.01)，恩度+DDP(d4-6)及恩度+DDP(d7-9)组抑瘤率明显高于其他处理组。
　　 2.不同方案治疗后MVD结果，恩度+DDP(d4-6)组MVD最低15.7±3.8/mm2，与其他各组比较差异有统计学意义(P<0.05)
　　 3.不同方案治疗后PCNA表达情况：PCNA表达于肿瘤细胞核内，治疗结束后恩度+DDP(d4-6)组PCNA呈低表达，恩度+DDP(d7-9)组呈中等强度表达，而其余各组均呈高表达。
　　 结论：
　　 抗血管生成药物恩度与顺铂联合治疗肿瘤时选择不同的用药时机可影响治疗效果，当恩度使肿瘤微血管成熟度最明显时应用顺铂，可取得最佳抑瘤效果。