天然药物人参皂苷和小檗碱的神经保护作用及机制研究

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是一种进行性发展的神经退行性疾病，是最常见的老年痴呆类型。AD的临床表现包括进行性记忆力减退和认知功能障碍等，该病在85岁以上人群中发病率为10％～30％，严重危害老年人健康。AD的主要病理特征包括:神经元的丢失，细胞外神经炎性斑块及细胞内神经原纤维缠结的形成。
　　 β-淀粉样多肽（β-amyloidpeptide，Aβ）是由淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein，APP)经γ和β分泌酶水解形成的异常多肽，具有神经毒性，过量Aβ的沉积是AD的特征性病变之一。研究证明，Aβ的产生与聚集是AD发病的关键因素。过量Aβ易聚集形成寡聚体，该寡聚体可以直接作用于神经元的突触、树突，破坏神经元回路，导致神经元损伤、凋亡。
　　 Aβ寡聚体还可通过与小胶质细胞（microglia，MG）表面受体结合，激活周围的小胶质细胞，过度激活的小胶质细胞合成并释放大量促炎性介质包括肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)，一氧化氮(nitricoxide，NO)，环加氧酶-2(cyclo-oxygenase-2，COX-2)，单核趋化蛋白-1(monocytechemoattractantprotein-1，MCP-1)，白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等，造成神经炎性反应。据报道激活的小胶质细胞介导的神经元死亡与NO、ROS以及促炎性细胞因子相关，这在多发性硬化(Multiplesclerosis，MS)、帕金森氏病(Parkinson'sdisease，PD)和肌萎缩侧索硬化（Amyotrophiclateralsclerosis，ALS）等疾病中均有发现。研究证明Aβ激活小胶质细胞引起的炎症反应也是AD的重要病理表现之一。
　　 鉴于神经元损伤和神经炎症在AD发生过程中的重要作用，本课题分别从抗神经元变性损伤和抗神经炎症两个方面，研究天然药物人参皂苷和小檗碱对中枢神经系统的保护作用及其可能机制，为天然药物治疗AD提供理论依据和实验证据。
　　 第一部分
　　 人参皂苷Rb1和Re对Aβ25-35诱导的神经元损伤保护作用研究
　　 [研究背景]
　　 人参是中国的传统中药，其药用价值已经得到普遍认可。临床研究结果显示人参对中枢神经系统、心血管系统、免疫系统功能具有不同程度的保护作用。现代药理学研究发现人参可调节大脑皮层的兴奋和抑制过程之间的平衡，促进学习记忆，具有益智功效。
　　 人参皂苷Rb1、Re是从人参中提取的两种有效单体，具有广泛的生理功能。动物实验研究证明Rb1可以部分恢复AD模型大鼠的学习和记忆功能。脑损伤大鼠模型中Re可通过抑制ATP酶活性下降来防止线粒体肿胀，提示其具有潜在的神经保护作用，但是具体机制不清。本课题拟通过建立AD细胞模型研究人参皂苷Rb1、Re对神经元损伤的保护作用及可能机制。
　　 [研究目的]
　　 Aβ25-35处理人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH建立AD细胞损伤模型，研究天然药物人参的有效成分Rb1、Re对神经细胞损伤的保护作用，探明其作用机制。
　　 [研究方法]
　　 Aβ25-35处理SK-N-SH细胞建立AD细胞损伤模型，分别用两种人参皂苷处理后，观察各项指标，包括:采用MTT法检测细胞活力;采用细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)检测试剂盒检测活性氧含量;比较损伤及药物处理组各项指标，明确人参皂苷的治疗效果，然后采用Westernblotting对可能涉及的信号通路中关键蛋白进行检测，初步发现可能的作用机制。
　　 [研究结果]
　　 1.细胞活力检测结果表明人参皂苷Rb1及Re均可缓解Aβ25-35损伤造成的细胞存活力下降;
　　 2.ROS检测结果表明Rb1和Re均可减轻Aβ25-35诱导的SK-N-SH细胞氧化应激;
　　 3.Westernblotting结果表明两种人参皂苷均可以抑制GSK-3β第216位苏氨酸的磷酸化并抑制Tau蛋白第396位丝氨酸的磷酸化。
　　 [结论]
　　 人参皂苷Rb1及Re均可减轻Aβ25-35诱导的细胞损伤;人参皂苷Rb1及Re均可抑制GSK-3β第216位苏氨酸的磷酸化并抑制Tau蛋白第396位丝氨酸的磷酸化，推测这可能是两种人参皂苷发挥其神经元保护作用的可能机制之一。
　　 第二部分
　　 小檗碱对AD神经炎症模型的保护作用及机制研究
　　 [研究背景]
　　 小檗碱(berberine，Ber)是一种异喹啉生物碱，主要存在于黄连、黄柏等多种植物中。小檗碱最初作为清热解毒药和抗菌药应用于临床，是一种天然的抗感染药。此外，小檗碱还可抑制肿瘤的生长和侵袭，且因其具有降低血糖含量、调节脂类代谢、清除自由基功能，国内常将其用于Ⅱ型糖尿病的临床治疗。此外，研究发现小檗碱可以抑制多种细胞中炎性介质的表达，初步明确了小檗碱的抗炎作用。
　　 中枢神经系统疾病往往伴有神经元的大量坏死以及凋亡，这些坏死病灶可以激活小胶质细胞并释放炎症因子。已经证实在AD患者以及小鼠疾病模型中，激活的小胶质细胞聚集在神经炎性斑块周围。Aβ诱导神经炎症的发生是AD的一个关键事件，小胶质细胞在该过程中起重要作用。已证明小檗碱具有较强的抗炎作用，然而小檗碱对Aβ引发的神经炎症反应的作用及相关机制尚未见报道。
　　 [研究目的]
　　 Aβ25-35处理细胞建立AD神经炎症模型，研究天然药物小檗碱的抗神经炎症作用及可能机制。
　　 [研究方法]
　　 Aβ25-35分别处理BV2细胞及原代胶质细胞建立AD神经炎症细胞模型，用不同浓度小檗碱处理，初步明确小檗碱的抗神经炎作用，观察的各项炎症相关指标包括:采用Real-timePCR方法检测炎性因子IL-6、MCP-1(CCL2)、COX-2和iNOS的mRNA表达水平;ELISA检测MCP-1和IL-6分泌情况;Westernblotting检测iNOS和COX-2的表达情况;明确小檗碱的抗炎作用后，采用Westernblotting、免疫荧光、EMSA对抗炎作用及可能涉及的信号通路进行检测，探明其作用机制。
　　 [研究结果]
　　 1.Real-timePCR和ELISA结果表明Aβ25-35可上调BV2细胞和原代胶质细胞中IL-6和MCP-1的表达，1～5μM的小檗碱可抑制IL-6和MCP-1的表达;
　　 2.Real-timePCR和Westernblotting结果表明Aβ25-35可上调BV2细胞和原代胶质细胞中iNOS和COX-2的表达，1～5μM的小檗碱则起抑制作用;
　　 3.Westernblotting结果表明Aβ25-35可上调BV2细胞中Akt，p38和ERK磷酸化水平，1～5μM的小檗碱可抑制Aβ25-35上调的Akt，p38和ERK磷酸化水平;
　　 4.Westernblotting结果表明Aβ25-35可上调BV2细胞中NF-κBp65磷酸化水平，小檗碱预处理则使NF-κBp65磷酸化水平降低;
　　 5.免疫荧光结果表明Aβ25-35可促进BV2细胞中诱导的NF-κBp65入核，小檗碱可抑制NF-κBp65入核;
　　 6.EMSA结果表明小檗碱可抑制BV2细胞中NF-κBp65的DNA结合活性。
　　 [结论]
　　 在小鼠原代胶质细胞和BV2细胞中，小檗碱均可显著抑制Aβ刺激引起的IL-6和MCP-1表达上调，还可抑制原代胶质细胞和BV2细胞中COX-2及iNOS的表达。进一步的机制研究发现小檗碱能够显著抑制Aβ25-35诱导的鼠源BV2细胞中NF-κB的激活。此外，小檗碱还可抑制BV2细胞中Aβ25-35介导的Akt，p38和ERK磷酸化，由此我们推测小檗碱对Aβ25-35介导的小胶质细胞炎症反应的抑制作用可能是通过抑制PI3K/Akt和MAPK途径来实现的。