用于蘑菇养殖的秸秆堆肥中高温纤维素降解菌的筛选鉴定及相关水解酶的研究

摘要

木质纤维素物质是地球上最丰富的可再生资源,利用微生物对其进行降解,转化为可被人类利用的有效能源,对解决日益严重的能源危机具有极其重要的意义。堆肥是木质纤维素被活跃降解的生境之一,本文从聊城莘县朝城镇堆制的用于蘑菇培养的高温秸秆堆肥中筛选获得具有明显羧甲基纤维素(CMC)水解圈的菌株,并对其进行相关性质研究,主要的工作内容和结果如下:
　　 1、秸秆堆肥中高温纤维素降解菌筛选鉴定。
　　 近年来不断有纤维素降解微生物得到分离和研究,但只有少数微生物产生的纤维素酶系能够完全水解纤维素,并用于工业化使用。本文通过CMC平板活性筛选,从聊城莘县朝城镇堆置的秸秆堆肥中筛选获得了9株具有明显CMC水解圈的菌株,其中B6、B60-1和B60-3从一次发酵堆肥中获得,属于链霉菌属,产木聚糖酶;D1、D2.1、D2.2、D2.3和D3从二次发酵堆肥中获得,为链霉菌属,具有CMCase活性;菌株E1虽然具有较明显的CMC水解圈,但没有检测到胞外酶活和菌体酶活,为芽孢杆菌属,基因组含有GH48纤维素外切酶基因。
　　 2、堆肥木质纤维素成分分析及二次发酵堆肥中放线菌多样性研究。
　　 通过分析堆肥各阶段样品的木质纤维素成分的分析发现在堆肥过程中秸秆的木质素相对含量有所上升,这是由于其降解速率远远小于纤维素和半纤维素而导致的累积效果;纤维素在一次发酵初期有明显降解,由40％下降到25％;半纤维素在堆肥过程中一直保持持续缓慢的降解。对二次发酵堆肥样品的放线菌多样性研究发现,其中的菌种多为未培养微生物,还不能明确其分类地位和作用。
　　 3、筛选菌株粗酶液性质研究。
　　 从二次发酵堆肥中筛选得到5株具有CMCase活性的菌株,其粗酶液表现相似的酶学性质:最适酶反应温度50-65℃,最适酶反应pH5.0。从一次发酵堆肥中筛选的3株菌,具有木聚糖酶活性,最适酶反应温度为70℃,在60℃孵育10h仍能保持60％以上的酶活力,最适酶反应pH较为广泛6.0-9.0,并表现较好的耐受性。对菌株B6的发酵进程测定,发现其可在较短时间内达到最大产酶量。同时,B6在以2％秸秆和0.5％peptone为碳氮源培养其产酶量较初始CMC发酵培养基培养时得到很大提高(10倍),为酶的大量获得提供了可能。
　　 4、菌株B6产木聚糖酶的分离纯化及质谱鉴定。
　　 对菌株B6的粗酶液经DEAE柱层析分离,SDS-PAGE复性电泳刚果红染色,菌株B6产分子量约为45kDa的木聚糖酶,该蛋白对不溶性木聚糖具有吸附结合能力,质谱鉴定未检索成功,推测其可能是未报道的蛋白。
　　 5、菌株B6木聚糖酶基因扩增。
　　 通过GH10、GH11木聚糖酶通用兼并引物扩增的到与链霉菌来源的木聚糖酶具有较高相似性的木聚糖酶基因片段,为进一步了解B6产木聚糖酶提供了可能。

目录

声明

摘要

缩略表(Abbreviation)

第一章 绪论

1．1 木质纤维素的结构

1．1．1 纤维素结构

1．1．2 半纤维素结构

1．1．3 木质素结构

1．2 木质纤维素降解微生物

1．2．1 纤维素降解微生物

1．2．2 半纤维素降解微生物

1．2．3 木质素降解微生物

1．3 木质纤维素降解酶

1．3．1 纤维素酶

1．3．2 半纤维素酶

1．3．3 木质素降解酶

1．4 立题依据和工作思路

第二章 高温纤维素降解菌的筛选鉴定

2．1 实验材料

2．1．1 样品来源

2．1．2 培养基和试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 菌种筛选

2．2．2 复筛

2．2．3 菌种的初步鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 纤维素降解菌的筛选

2．3．2 酶活检测

2．3．3 菌种鉴定

2．4 讨论

第三章 秸秆堆肥木质纤维素成分分析及其微生物多样性分析

3．1 材料与仪器

3．1．1 样品采集

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 木质纤维素成分测定

3．2．2 微生物多样性分析

3．3 结果与分析

3．3．1 堆肥各阶段样品木质纤维素成分分析

3．3．2 一次发酵秸秆堆肥不同深度样品木质纤维素成分分析

3．3．3 二次发酵堆肥样品放线菌多样性分析

3．4 讨论

第四章 产纤维素酶分离菌粗酶液性质分析及发酵条件初步优化

4．1 实验材料

4．1．1 菌种

4．1．2 培养基和试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 粗酶液制备

4．2．2 酶活检测方法

4．2．3 发酵进程测定

4．2．4 蛋白含量分析

4．2．5 碳源对酶产量的影响

4．2．6 氮源对酶产量的影响

4．3 结果与分析

4．3．1 酶反应最适温度及温度稳定性的测定

4．3．2 酶反应最适pH及pH稳定性的测定

4．3．3 发酵进程酶活分析

4．3．4 发酵培养基对酶产量的影响

4．4 讨论

第五章 B6菌株产木聚糖酶蛋白纯化及其基因克隆的研究

5．1 材料与方法

5．1．1 菌种及培养基

5．1．2 引物

5．1．2 主要试剂与仪器

5．1．3 酶的分离纯化

5．1．4 不溶性木聚糖、Avicel吸附研究

5．1．5 质谱鉴定

5．1．6 木聚糖酶基因扩增

5．1．7 菌株B6基因组文库构建

5．1．8 其他分析方法

5．2 结果与分析

5．2．1 木聚糖酶的离子交换层析分离

5．2．2 木聚糖酶对不溶性木聚糖、Avicel的吸附研究

5．2．3 质谱鉴定

5．2．4 木聚糖酶基因扩增

5．2．5 B6基因组文库构建及筛选

5．3 讨论

全文总结

参考文献

致谢

学位论文评阅及答辩情况表