以斑马鱼为模型研究神经靶酯酶的功能及其在神经退行性疾病发生中的作用机制

摘要

神经靶酯酶(neuropathy target esterase，NTE)又称PNPLA6，是patatin样磷脂酶(patatin-like phospholipase，PNPLA)家族成员。NTE蛋白位于内质网上，其结构根据功能分为N端的调控区和C端的酶催化活性区，NTE对真核生物细胞膜主要成分磷酸卵磷脂降解有促进作用。在对有机磷(orgnaophosphorus，OPs)导致的迟发性神经病(OP-induced delayed neuropathy，OPIDN)的研究中发现，NTE的活性受到OPs的抑制。OPIDN是以感觉障碍、运动失调、下肢麻痹甚至截瘫为特征的迟发性神经病，主要病理改变是长轴突远端发生轴突变性。OPIDN通常在单次接触磷酸三甲苯酯(tri-o-cresylphosphate，TOCP)等OPs后1-3周内发病，所以称为OPs导致的迟发性神经病。
　　 近年来，在对另外一种神经退行性疾病--遗传性痉挛性截瘫(hereditaryspastic paraplegia，HSP)发病机制的研究中发现，NTE基因突变导致一类常染色体隐性遗传性HSP。HSP是一组具有高度临床和遗传异质性的神经系统遗传病，主要临床特征是进行性双下肢肌张力增高和肌无力，主要的病理改变是皮质脊髓束中上运动神经元的轴索变性和脱髓鞘。HSP在临床上可以分为单纯型和复杂型两种类型：仅表现为双下肢进行性肌张力增高和肌无力的称为单纯型；同时伴有肌萎缩、肌张力障碍、共济失调、癫痫、精神发育迟滞、视神经萎缩或听力障碍等症状的称为复杂型。HSP的发病年龄多见于儿童期或青春期，目前临床上缺乏有效的治疗方法，给患者本人及其家庭带来极大的痛苦和沉重的负担。
　　 M陋基因在果蝇中的同源基因sws突变时，SWS蛋白的酶活性完全丧失，这种果蝇的神经系统发生退行性改变，包括空泡化、胶质细胞多层缠绕神经元轴突和神经元凋亡。Nte完全敲除小鼠在胚胎发育早期死亡，限制了利用小鼠模型研究NTE对神经发育和维护作用。在后续的研究中，研究者建立了脑特异性敲除Nte的小鼠模型，结果证明Nte缺失扰乱了内质网磷脂内环境稳态，细胞内出现异常累积的网状结构和空泡。
　　 虽然通过对以上动物模型的研究，NTE功能的重要性已经得到一些了解，但是对于NTE在动物发育过程中的具体功能以及其导致运动神经元疾病的具体机制尚不清楚。本研究通过吗啉代反义核苷酸技术建立了抑制nte表达的斑马鱼模型，发现抑制nte表达导致了斑马鱼尾弯表型，还出现了其它多个系统的发育缺陷，并且导致运动神经元轴突出现分叉和截短。本研究还发现Nte的酯酶活性是其生物功能所必需的，并且抑制nte表达导致骨形成蛋白(bone morphogeneticproteins，BMPs)信号途径上调，抑制nte表达导致斑马鱼多系统异常和轴突发育缺陷可能是通过BMP信号途径作用的。
　　 第一部分抑制nte基因表达影响斑马鱼胚胎正常发育
　　 斑马鱼作为脊椎动物模式生物具有诸多优势，斑马鱼Nte蛋白与人类NTE蛋白的同源性高达73％，本研究以斑马鱼作为动物模型分析NTE的功能以及它在神经退行性疾病中的作用机制。
　　 1)本研究通过PCR扩增得到的斑马鱼nte基因编码序列为4026 bp，编码1342个氨基酸。在此基础上，我们构建了斑马鱼nte基因的真核表达载体pcDNA3.1A-nte。
　　 2)通过RT-PCR和实时定量PCR分析，发现斑马鱼Nte在胚胎发育早期已经有表达，并且在胚胎发育的整个过程中持续表达。
　　 3)为了研究NTE蛋白的功能，我们采用吗啉代反义核苷酸(morpholino antisenseoligonucleotides，MOs)技术抑制斑马鱼nte基因表达，建立了抑制nte表达的斑马鱼模型，并在其胚胎发育的前5天对其发育过程中出现的异常进行了观察。
　　 4)观察发现，36hpf时正常胚胎尾部伸直，而nte MO注射组的367个胚胎中53.7％出现了尾弯表型，对照组的333个胚胎中只有16.2％出现尾弯表型。
　　 5)为了检测抑制nte表达对胚胎运动能力的影响，根据5dpf胚胎被触碰后的逃避反应能力，将其分为三组：运动能力正常、运动能力损伤和不能运动。结果显示nte MO注射组133个胚胎中54.1％出现运动能力缺陷(运动能力损伤和不能运动)，而对照组139个胚胎中只有23.7％出现运动能力缺陷(运动能力损伤和不能运动)。nte MO注射组胚胎的运动能力明显低于对照组。
　　 6)在胚胎发育早期(4体节期和6体节期)nte MO注射组胚胎的头部.尾部间距明显大于对照组胚胎，nte MO注射组胚胎体轴发育具有缺陷。
　　 7)在nte MO注射组的胚胎中还发现了一些其它异常，比如眼和听泡较小、脑发育缺陷等，以及围心腔扩大、心脏畸形、搏动缓慢和血流缓慢等。
　　 综上所述，本部分中我们构建了斑马鱼nte的真核表达载体pcDNA3.1A-nte，并且建立了抑制nte表达的斑马鱼模型。抑制nte表达导致斑马鱼胚胎出现多种发育异常，最明显的是尾部弯曲和运动能力降低，表明Nte在斑马鱼胚胎发育过程中起到重要的作用，我们建立的抑制nte表达的斑马鱼模型是研究NTE功能的有效模型。
　　 第二部分 NTE的正常生物学功能依赖于其酯酶活性
　　 NTE的结构分为N端的调控区和C端的酶催化活性区两部分，其中酶活性催化区的Ser966、Asp960和Asp1086是其酶活性所必需的关键氨基酸。其中Ser966的改变使NTE酯酶活性完全丧失，Asp960和Asp1086两个氨基酸改变都可导致NTE酯酶活性降低到1/10000。为了验证抑制斑马鱼nte表达表型的特异性以及Nte蛋白的生物学功能是否依赖于其酯酶活性，我们进行了拯救实验。
　　 1)本研究构建了人NTE基因的真核表达载体pCS2-NTE，体外转录出NTEmRNA并与nte MO共注射，结果此组373个胚胎中具有尾弯表型的胚胎比例降低到14.2％，运动能力检测结果表明124个胚胎中具有运动能力缺陷的胚胎比例降低到29.9％，说明野生型人NTE mRNA可以拯救抑制nte表达的斑马鱼表型。
　　 2)接下来将pCS2-NTE定点突变，分别突变三个NTE酯酶活性关键氨基酸的编码序列，体外转录出突变的NTEmRNA并分别与nte MO共注射，结果都不能拯救抑制nte表达的斑马鱼表型。
　　 综上所述，本研究通过nte MO注射构建的抑制nte表达的斑马鱼模型表型具有良好的特异性，并且证明Nte在斑马鱼发育过程中所起到的作用依赖于其酯酶活性，即失去酯酶活性的Nte不能发挥正常的生物学功能。
　　 第三部分抑制nte基因表达导致斑马鱼运动神经元发育缺陷
　　 在神经退行性疾病OPIDN中发现NTE酶活性受到抑制，并且NTE酶活性部位的突变导致上运动神经元疾病HSP，说明NTE对运动神经元发育和维护具有重要的作用。斑马鱼脊髓中的神经元主要分为运动神经元、感觉神经元和中间神经元三种类型，本部分分别对这三种神经元及其轴突的生长情况进行了检测，分析了抑制nte基因表达对其生长状况的影响。并通过吖啶橙染色、TUNEL检测及电子显微镜观察等方法对其发生机制作了初步研究。
　　 1)用抗体Znp-1对26hpf和36hpf斑马鱼胚胎进行免疫组织化学染色，观察初级运动神经元轴突的生长状况，发现nte MO注射组的胚胎运动神经元轴突在生长过程中出现分叉和截短(未正常伸长至腹侧肌肉)。在36hpf分别对nte MO注射组和对照组胚胎单侧10个体节内出现至少一根分叉或者截短轴突胚胎的比例进行了统计。结果显示nte MO注射组有69.2％侧的胚胎有至少一根轴突截短，而对照组仅31.3％侧的胚胎有至少一根轴突截短，具有显著差异；nte MO注射组65.2％侧胚胎至少有一根轴突分叉，对照组仅有29.2％侧胚胎至少有一根轴突分叉，也具有显著差异。通过Zn12抗体染色分析72hpf的次级运动神经元轴突生长状况，发现次级运动神经元轴突也存在分支和截短两种缺陷。
　　 2)为了验证抑制nte表达造成的斑马鱼轴突生长缺陷是否是由尾部弯曲表型导致的，将18体节期nte MO注射组和对照组胚胎脊髓细胞分别在体外培养，并分析运动神经元的生长状况，结果显示取自nte MO注射组胚胎的运动神经元轴突出现明显多于对照组的分叉，并且轴突平均长度明显比对照组短。通过移植实验将带有RLDx标记的早期nte MO注射组和对照组胚胎细胞分别移入早期的野生型斑马鱼胚胎中。结果显示36hpf时，野生型胚胎中来自nte MO注射组胚胎的运动神经元出现分叉和截短的轴突明显多于对照组。从而证明了抑制nte表达造成的斑马鱼轴突生长缺陷是由于轴突自身缺陷导致的，而不是轴突生长外部环境导致的。
　　 3)用乙酰化的α-tubulin抗体对36hpf胚胎进行免疫组织化学染色，观察RB-感觉神经元和侧线，没有观察到明显异常。用抗体3A10对36hpf胚胎Mauthner中间神经元和轴突进行免疫组织化学染色，没有观察到明显异常。
　　 4)用HuC/D抗体对成熟神经元进行免疫组织化学染色，观察其生长状况，未发现明显异常。用39.4D5抗体对30hpf斑马鱼胚胎运动神经元进行染色，发现nte MO注射组胚胎运动神经元数目显著少于对照组。
　　 5)使用吖啶橙检测30hpf胚胎的细胞凋亡情况，结果显示在nte MO组斑马鱼胚胎的脑部和尾部有明显多于对照组胚胎的凋亡细胞。与进一步的TUNEL检测的结果相符。
　　 6)通过电子显微镜观察抑制nte表达对胚胎超微结构造成的影响，发现抑制nte表达胚胎出现细胞内空泡、异常累积的膜结构、内质网和线粒体结构异常以及增多自噬，并通过Western Blot方法检测到了自噬过程中的标志分子LC3-Ⅱ的增加。
　　 以上结果说明抑制nte表达导致运动神经元轴突生长缺陷，这种缺陷是轴突自身缺陷导致的，而抑制nte表达对中间神经元和感觉神经元及轴突的生长没有明显影响。对抑制nte表达胚胎超微结构的检测提示这种影响可能与细胞内膜结构异常导致的自噬和凋亡增加有关。
　　 第四部分抑制nte基因表达上调BMP信号途径
　　 轴突的生长和导向受到多种细胞信号途径的调节，其中BMP信号途径抑制被认为是轴突生长所必需的，最近的研究发现多种HSP蛋白是BMP信号途径的抑制分子。我们检测了BMP信号的标志分子P-Smad1/5/8的表达水平，结果显示nte MO注射组胚胎的P-Smad1/5/8表达水平明显升高，说明抑制nte表达导致BMP信号途径上调。Dorsomorphin(DM)是BMP信号途径的小分子抑制剂，用6μM DM在10hpf处理nte MO注射组胚胎，可以拯救抑制nte表达产生的尾弯表型和运动能力降低，证明抑制nte表达对斑马鱼胚胎发育的影响是通过上调BMP信号途径作用的。
　　 综上所述，斑马鱼是NTE功能及其在神经退行性疾病中作用机制研究的良好模型。本研究通过吗啉代反义核苷酸技术首次建立了抑制nte表达的脊椎动物模式生物斑马鱼模型。并通过研究发现抑制nte表达造成了斑马鱼胚胎早期发育异常，包括：尾部弯曲、运动能力缺陷和运动神经元生长缺陷等，并且还发现Nte的生物学功能依赖于其酯酶活性。另外，本研究还发现抑制nte表达导致了BMP信号途径的上调，首次证实NTE是。BMP信号途径的抑制剂。本研究对进一步了解NTE的功能及其在神经退行性疾病中的作用机制具有重要意义。