5-ALA-PDT诱导皮肤鳞状细胞癌A431细胞凋亡的体内外研究

摘要

目的：皮肤鳞状细胞癌(Squamous cell carcinoma,SCC)是表皮角质形成细胞异常增生而形成的一种表皮或附属器的恶性肿瘤，增长迅速，恶性程度较高，应用传统治疗方法容易造成面容及器官功能等不同程度的损伤，光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)是近年快速发展的治疗皮肤恶性肿瘤的新方法，可选择性杀死肿瘤细胞而对邻近的正常组织影响较小，疗效理想。本研究试图通过体外实验与体内实验的结合，为临床应用5-ALA-PDT治疗皮肤鳞状细胞癌提供一定的理论和实验室依据。
　　方法：
　　(1)应用MTT法测定不同药物浓度及培养时间下5-ALA-PDT对皮肤鳞状细胞癌A431细胞的影响，应用实时荧光定量PCR及Western blot检测5-ALA-PDT后不同光照剂量下皮肤鳞状细胞癌A431细胞中Caspase-3、Caspase-7表达量的变化;
　　(2)构建肿瘤模型:C57BL/7雄鼠（3-4周），饲养于动物中心，背部脱毛，A431细胞消化后，立即用0.9％生理盐水溶解，皮下注射于背部脱毛区，地塞米松2ml/d腹部皮下注射，观察背部肿瘤生长变化，每周记录一次肿瘤生长情况（肿瘤直径a与厚度d），8周后切取背部正常皮肤行HE染色，切取肿瘤组织行HE染色及CKpan标记;
　　(3)实验分组:SCC肿瘤体积约64mm3入组(N=20)，实验组A组（10只）:ALA（浓度20％）+照光组(50J/cm2);B组（3只）:单独涂抹ALA组;C组（3只）:单独照光组;D组（4只）:不进行任何处理，光照时间均为30min，治疗周期为3周，治疗前后测量肿瘤的直径(a)和厚度(d)，计算肿瘤体积V=ad2/2,单位以毫米(mm)表示。
　　(4)免疫组化:光动力治疗前及结束后（一周、两周、三周）切取各组C57BL/7雄鼠背部肿瘤组织制备石蜡切片，免疫组化法检测Caspase-3及MMP-9的表达变化。
　　结果：
　　(1)当ALA浓度为3.2mmol/L，培养时间为120min，光照剂量为80J/cm2时，经实时荧光定量PCR及Western blot检测显示，5-ALA-PDT对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞中Caspase-3和Caspase-7的表达量的影响最强，有统计学意义;
　　(2)ALA浓度为20％，光照剂量为50J/cm2，光照时间为30min时，光动力治疗一周、两周、三周后，A组即5-ALA-PDT组具有明显的抑制肿瘤生长的作用，与治疗前相比肿瘤体积明显缩小(P＜0.05)，B、C、D三组没有抑制肿瘤生长的作用;
　　(3)ALA浓度为20％，光照剂量为50J/cm2，光照时间为30min时，光动力治疗一周、两周、三周后皮肤鳞状细胞癌中Caspase-3的表达呈现动态递增过程，MMP-9的表达呈现动态递减过程，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，对照组中Caspase-3及MMP-9的表达变化无明显差异(P＞0.05)。
　　结论：
　　(1)人皮肤鳞状细胞癌A431细胞中Caspase-3和Caspase-7mRNA和蛋白质的表达量低于Hacat细胞，推测Caspase-3及Caspase-7等Caspase家族成员与肿瘤的发生呈负相关;由5-ALA-PDT处理后不同药物浓度、光照时间、光照剂量下A431细胞中Caspase-3及Caspase-7的差异性动态表达变化，推测5-ALA-PDT可能通过诱导皮肤鳞状细胞癌A431细胞的凋亡发挥作用;
　　(2)3次5-ALA-PDT治疗能够有效抑制皮肤鳞状细胞癌的生长;
　　(3)经5-ALA-PDT治疗三个周期后，对照组中Caspase-3及MMP-9的表达变化无明显差异(P＞0.05)，实验组MMP-9的表达呈动态递减趋势，Caspase-3的表达呈动态递增趋势，说明5-ALA-PDT在诱导肿瘤细胞凋亡过程中起到了一定的作用，而且治疗三周时可以起到较好的治疗效果，推测随着治疗周期的延长，可能会起到更好的巩固治疗效果。