基于靶标结构的新型杂环类HIV--1抑制剂的设计、合成和活性评价

摘要

人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)是艾滋病的主要病原体。自从1981年发现以来，目前已经成为危害人类生命健康的重大传染性疾病。虽然高效抗逆转录疗法(Highly Active Antiretroviral Therapy，HAART)的实施是抗艾滋病治疗的一项重大突破，但是耐药性的出现及长期服药的毒性问题极大地限制了该疗法的应用，因此新型抗艾滋病药物的研发依然刻不容缓。 HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)是HAART疗法的重要组成部分。NNRTIs具有结构多样性，选择性作用于HIV-1逆转录酶(Reverse Transcriptase，RT)的疏水性口袋。该类药物具有高效低毒、特异性强的优点，然而易产生耐药性的缺陷使该类药物迅速丧失临床效价，因此新型、高效、低毒、广谱抗耐药性的NNRTIs的研发是目前抗HIV药物研究的热点之一。由于NNRTIs结合口袋(Non-nucleoside Inhibitor-Binding Pocket, NNIBP)是在NNRTIs的存在下诱导产生的，因此完全基于HIV-1RT的三维结构进行全新抑制剂设计还存在较大困难，故选择研发前景较大的化合物为先导，在对其构效关系及结合模式分析的基础上，综合运用结构生物学信息、计算化学技术及传统药物化学策略进行先导化合物的优化，是当前发现新一代NNRTIs药物的有效途径。 HIV-1整合酶(Integrase，IN)能介导逆转录病毒DNA整合到宿主细胞DNA中，整合过程包括两步反应:第一步是3'端加工(3'-end processing，3EP)，即IN切割并结合病毒DNA形成IN-病毒DNA复合物;第二步是链转移(Strandtransfer, ST)，即IN-病毒DNA复合物切割并结合宿主细胞DNA，将病毒DNA整合到宿主DNA中，并随着宿主DNA的复制而复制。如果能抑制病毒DNA的整合过程，就防止了细胞被永久性的感染，而且人体细胞中没有IN的功能类似物，使得IN抑制剂选择性很高，对于正常细胞毒性小，所以针对IN催化反应的抑制剂设计已经成为国际上抗AIDS药物研究的热点。 本论文第一部分在对DAPY类非核苷类HIV-1逆转录酶抑制剂的构效分析及课题组之前的研究基础上，利用分子杂合策略，将N-苄基取代哌啶环部分引入到目标化合物右侧，来替换原有的对氨基苯腈基团;并利用生物电子等排体原理将先导化合物中间杂环进行合理替换为噻吩并嘧啶环和咪唑并嘧啶环（嘌呤），突破了原有专利的限制，以获得具有自主知识产权的新型NNRTI分子。设计并合成得到了两个全新系列的化合物:噻吩并嘧啶系列DAPY类化合物和咪唑并嘧啶环（嘌呤）系列DAPY类化合物。所得化合物经过ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR确证结构。并利用MTT法在MT-4细胞中对所有的化合物进行了抗野生型HIV-1(IIIB)、HIV-2(ROD)及K103N/Y181C双突变型HIV-1(RES056)的活性筛选。 活性结果显示噻吩并嘧啶系列化合物具有很好地抗HIV-1活性，其抗野生型HIV-1的EC50值在3.25-26.56 nM范围内。化合物FF-06，FF-07，FF-08的选择指数高于12000，活性最好的化合物FF-06对野生型HIV-1病毒的EC50为3.25 nM，选择指数SI为12740。噻吩并嘧啶系列化合物K103N+Y181C(RES056)耐药突变型HIV-1的抑制活性在0.29-24.2μM范围内，明显强于阳性对照药物奈韦拉平(NVP)、拉米夫定(3TC)、去羟肌苷(ddI)和地拉韦定(DLV)。咪唑并嘧啶环（嘌呤）系列化合物抗野生型HIV-1的活性相比噻吩并嘧啶类化合物较低，部分化合物的EC50值在3.93-27.3μM范围内。嘌呤系列化合物在浓度高达毒性浓度（CC50值）时，对K103N/Y181C耐药突变型HIV-1和HIV-2(ROD)没有抑制作用。 通过对噻吩并嘧啶系列DAPY类化合物和咪唑并嘧啶环（嘌呤）系列DAPY类化合物构效关系的分析可以发现:当化合物的右侧哌啶环连接的Ar为极性亲水性基团时（如4-CONH2-Ph，4-SO2NH2-Ph，4-SO2CH3-Ph，4-CO2CH3-Ph），其抗HIV-1病毒活性要高于Ar为疏水基团的化合物。可能的原因是Ar为极性亲水性的基团时，更有利于化合物与蛋白-溶剂界面的亲水性环境相契合。 同时，本论文将活性最好的化合物FF-06进行了分子对接研究，结果发现FF06与HIV-1逆转录酶的结合模式与先导化合物基本一致，进一步验证了本论文利用分子杂合策略设计新型DAPY类HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂的合理性。 本论文第二部分在对S-DABO类HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂的构效分析及本课题组之前的研究基础上，对S-DABO类化合物C2侧链进行了修饰，采用“点击化学”引入了全新的三氮唑侧链，合成了2个系列42个全新的S-DABO类化合物，并对所有的化合物进行了抗HIV活性筛选，42个化合物中6个化合物(B5b1，B5B3-B5b7)具有较好的抗野生型HIV-1活性，其EC50值在微摩尔水平，活性高于对照药物去羟肌苷(EC50=23.20μM)，其中化合物B5b7显示了较好的抗野生型HIV-1活性(EC50=3.22μM)，与对照药物拉米夫定(EC50=2.24μM)相当。通过对该系列化合物的构效分析发现:(1)嘧啶环C6位1-萘甲基的取代对化合物活性不利，在1-萘甲基系列只有化合物A5b7表现出较弱的HIV-1抑制作用，所有C6位2，6-二氯苄基取代的化合物活性普遍好于1-萘甲基取代的化合物。(2)在已报道的S-DABOs构效关系中，嘧啶环的C5位取代基对化合物活性有很大影响，本实验中嘧啶环的C5位甲基取代的化合物(B5b1，B5b7)活性最好;在C5位未取代的子系列(B5a1-B5a7)中，化合物(B5a1)也有10微摩尔级别的活性;当C5位引入碘原子，化合物活性消失。(3) S-DABOs嘧啶环C2侧链末端苯环上的取代基不同能显著影响化合物的抗HIV活性，在子系列（B5b1-B5b7）中，取代基SO2NH2(B5b7)对活性最有利，取代基活性顺序依次是:4-SO2NH2＞4-COMe＞4-OMe＞4-CN＞4-CONH2＞4-H＞4-F。此外，在嘧啶环C2侧链中引入三唑类结构并没有显著提高化合物的抗HIV活性。本论文的研究为S-DABO构效关系研究提供了一些新线索，为发现更有效的NNRTIs提供了参考。 本论文第三部分将目前处于临床研究阶段的化合物PF-4776548作为先导化合物，基于骨架跃迁策略，将其中的吡啶异羟肟酸基团更换为喹唑啉酮杂环，以模拟其金属螯合能力，并克服异羟肟酸类化合物代谢稳定性差的缺点。同时在喹唑啉酮的苯环部分通过点击化学的方法引入结构多样性的取代基，设计并合成了一系列新型喹唑啉酮类衍生物(M01-M13，E01-E13)，且所合成化合物的结构均经过波谱分析验证。对所合成的化合物应用MTT法进行了体外抗野生型HIV-1(IIIB)、HIV-2(ROD)的细胞活性测试。从活性结果看出，该系列化合物并没有表现出抗HIV的细胞活性，其细胞毒性较大，CC50值在1.12-18.71μM范围内，其中有9个化合物CC50值小于2μM，这与实验设计预期相差甚远。该结果说明了我们实验设计思路还需改进，另一方面该系列化合物的细胞毒性原因或抗肿瘤方面是否有潜在活性也需要探索。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 概述

第一节 HIV-1的生命周期

1．HIV的生物结构和复制周期

2．HIV-1的药物治疗和上市药物介绍

第二节 HIV-1逆转录酶和NNRTIs

1．HIV-1逆转录酶结构与功能

2．HIV-1逆转录酶抑制剂

3．NNRTIs的作用机制

4．NNRTIs耐药性问题

5．NNRTIs的上市药物

第三节 DAPY类HIV-1 NNRTI的研究进展

1．DAPY类NNRTIs研发过程

2．DAPY类NNRTI的研究进展

第四节 S-DABO类NNRTIs的研究进展

1．C2位结构修饰与构效分析

2．C6位结构修饰与构效分析

3．N3，C4，C5位结构修饰与构效分析

第五节 HIV-1整合酶及其抑制剂研究概述

1．整合酶的结构

2．整合酶的功能

3．整合酶抑制剂

4．整合酶抑制剂上市药物

第二章 新型DAPY类衍生物的设计、合成与活性研究

第一节 新型DAPY类衍生物的设计

第二节 目标化合物的合成

1．仪器与试剂

2．目标化合物的合成

第三节 新型DAPY类化合物活性研究

1．活性测试方法

2．DAPY类化合物活性结果与讨论

3．分子模拟研究

第四节 本章小结

第三章 S-DABO类HIV-1逆转录酶抑制剂的设计、合成与活性研究

第一节 目标化合物的设计

1．现有构效关系分析

2．新型S-DABOs目标化合物的设计

第二节 新型S-DABOs目标化合物的合成

1．仪器与试剂

2．目标化合物的合成

3．合成实验讨论

第三节 新型S-DABOs目标化合物活性研究

1．活性测试方法

2．S-DABOs活性结果与讨论

3．分子模拟研究

第四节 本章小结

第四章 新型喹唑啉酮类HIV-1整合酶抑制剂的设计、合成与活性研究

第一节 新型喹唑啉酮类HIV-1整合酶抑制剂的设计

第二节 喹唑啉酮类HIV-1整合酶抑制剂的合成

1．仪器与试剂

2．目标化合物的合成

3．合成实验讨论

第三节 喹唑啉酮类HIV-1整合酶抑制剂的活性研究

1．活性测试方法

2．喹唑啉酮类HIV-1整合酶抑制剂活性结果与讨论

第四节 本章小结

第五章 总结与展望

第一节 总结

第二节 展望

参考文献

附录

致谢

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