抗肿瘤药物的酶法鼠李糖基化修饰及α-l-鼠李糖苷酶的分子改造

摘要

糖苷酶，即糖苷水解酶(glycosidase，glycoside hydrolase，EC3.2.1)，在动物、植物和微生物中普遍存在，能够水解糖苷键，同时一些糖苷酶在体外还具有催化糖苷合成的能力。这类酶的优点是酶源丰富、性质十分稳定、反应途径简单而且底物价格低廉，对糖苷合成的催化不仅具有严格的立体专一性还具有一定的区域选择性，因此是催化糖苷合成的重要工具。
　　α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase，EC3.2.1.40)能够使糖苷化合物非还原端的α-L-鼠李糖苷键发生断裂，是重要的糖苷水解酶类，其中大部分属于糖苷酶78家族，大多为构型翻转酶类。天然存在的简单和复杂的α-L-鼠李糖苷分子（如人参皂苷、柚苷、橙皮苷等）都能被α-L-鼠李糖苷酶水解，其中一些α-L-鼠李糖苷酶还能以鼠李糖为供体通过逆水解反应催化鼠李糖苷的合成，在制药、化学和食品等领域应用十分广泛。产酶菌株的筛选、酶的分离纯化和水解活性的利用是目前国际上α-L-鼠李糖苷酶的研究热点，但是有关α-L-鼠李糖苷酶的基因克隆、重组表达、催化糖苷合成和分子改造方面的研究还较少。
　　研究表明某些肿瘤细胞表面存在鼠李糖凝集素，能够特异性地结合鼠李糖。抗肿瘤药物的糖基化修饰会增强药物的靶向性、减少对正常细胞的损害、减少药物给剂量以及提高疗效，而且还可以用来研究不同肿瘤细胞的药物敏感性。鼠李糖基化合物是一类含有鼠李糖基的化合物，一般是单个或多个鼠李糖基通过不同键型糖苷键连接到多种受体（单糖、寡糖、烷基、皂苷和生物碱等）分子上所形成的，不仅具有良好的生物活性，而且具有重要的生物学功能。鼠李糖基化合物在天然化合物（如糖蛋白及花青素、植物细胞壁、类黄酮和三萜烯类等）中普遍存在，在多糖抗原结构如鼠李糖脂、细菌杂多糖和细菌外膜脂的重复单元中也很普遍。从天然原料中提取和化学法合成鼠李糖基化合物的缺点是步骤繁琐导致得率较低，并且不利于人类健康和环境保护。而酶法合成鼠李糖基化合物的优势是不但具有严格的立体选择性和一定的区域选择性，而且反应条件温和、对环境无害。
　　本实验室前期从Alternaria sp.L1中分离纯化了一种α-L-鼠李糖苷酶RhaL1，并且克隆了该酶基因。本论文利用该酶具有催化糖苷合成的能力，以鼠李糖为供体，两种临床抗肿瘤药物羟基脲和5-氟-2'-脱氧脲核苷为受体，通过逆水解反应催化合成了抗肿瘤药物的鼠李糖苷化合物。合成产物通过凝胶过滤层和高效液相色谱进行分离、纯化，质谱鉴定了羟基脲鼠李糖苷和5-氟-2'-脱氧脲核苷鼠李糖苷的分子量，核磁共振解析了产物5-氟-2'-脱氧脲核苷鼠李糖苷结构为3'-O-α-L-鼠李糖基-5-氟-2'-脱氧脲苷和5'-O-α-L-鼠李糖基-5-氟-2'-脱氧脲苷。但是该原始酶催化抗肿瘤药物鼠李糖苷的产量比较低，我们计划对其进行分子改造以提高其催化效率。
　　本论文将Alternaria sp.L1的RhaL1与已知晶体结构、来源于Streptomycesavermitilis的α-L-鼠李糖苷酶（SaRha78A，蛋白晶体编号3w5n）进行序列比对及结构分析，预测出该酶的酸碱催化位点分别为Asp257和Glu530。同时对结合有鼠李糖分子的RhaL1的三维结构进行模拟，经过与SaRha78A比对，推测RhaL1的Asp252、Asp257、Asp264、 Trp369、Glu530、His553和Tyr302都能和鼠李糖分子形成直接或间接的氢键， Trp369、Trp261、Tyr316、和Pro366参与催化活性中心的疏水口袋的组成。根据鼠李糖苷酶的催化机制，我们推测这些氢键在稳定底物（供体）及催化（糖苷）合成反应方面有重要作用，而酶活性中心疏水腔的结构也与底物分子的稳定性有关，根据距离供体分子的距离判断可能与其发生相互作用的氨基酸还有Arg548和Trp555。采用Easy Mutagenesis System对上述氨基酸位点进行定点突变，获得以下单点突变的突变酶:D252N、D252A、D257N、W261A、W261Y、D264N、D264A, Y302F, Y316F, W369A, W369Y, E530D, E530Q, R548A, H553A,W555A，并通过毕赤酵母表达重组突变酶。其中突变酶D252N、D252A、D257N、W261A、D264N、D264A、W369A、E530D、E530Q同时丧失了水解活性和逆水解活性，突变酶W261Y、Y302F、Y316F、R548A、W555A保留了水解活性和逆水解活性，突变酶W369Y、H553A只保留了逆水解活性。对保留了逆水解活性的突变酶W261Y、Y302F、Y316F、W369Y、R548A、H553A、W555A以甘露醇为受体进行了鼠李糖苷合成反应研究，对其逆水解产物进行TLC和HPLC分析结果显示突变酶Y316F、R548A与原始酶相比，糖苷合成产率均有所提高，其中突变酶Y316F催化糖苷合成的产率最高，比原始酶提高了57％。通过对RhaL1单点突变结果的分析了解到靠近供体分子异头碳的氨基酸突变之后，酶会同时丧失水解活性和逆水解活性，而那些远离异头碳特别是构成疏水口袋的氨基酸突变之后，酶的水解活性和逆水解活性大多数情况下不会丧失。因此为了提高酶的逆水解活性，应该将酶的改造重点集中在远离异头碳且对稳定底物分子有重要作用的氨基酸上。
　　构建pPIC9K/Y316F重组质粒，在毕赤酵母KM71中高效表达突变酶Y316F，SDS-PAGE显示重组蛋白的单亚基分子量为～120kDa，与预测分子量一致;突变酶Y316F对人工底物pNPR的Km值为0.52mM，Vmax为0.89nM/min，与原始酶相比对人工底物pNPR的亲和力更强。突变酶Y316F的最适pH为6.5-7.5，在pH3.5-10.5的范围内稳定，pH稳定性与原始酶相比有所增强。最适反应温度为60℃，在25℃-55℃范围内保温2小时，能够保留80％以上的活性，表现出的温度稳定性与原始酶性质类似，但是最高耐受温度有所增强;当以甘露醇、山梨醇、果糖、麦芽糖、蔗糖为受体时，与原始酶相比，突变酶Y316F催化糖苷合成的产率均得到了提高，特别是当以山梨醇、麦芽糖和蔗糖为受体时，分别提高了94％、108％和106％。

目录

声明

摘要

缩写词表

第一章 前言

1．1 糖苷酶及其在糖类合成中的应用

1．1．1 糖苷酶作用机制

1．1．2 糖苷酶在糖类合成中的应用

1．1．3 糖苷酶的分子改造

1．2 α-L-鼠李糖苷酶的研究进展

1．3 肿瘤药物的糖基化修饰

1．4 鼠李糖基化合物

1．4．1 鼠李糖基化合物的功能

1．4．2 鼠李糖基化合物的制备

1．5 常用微生物蛋白表达系统

1．5．1 大肠杆菌表达系统

1．5．2 酵母表达系统

1．6 糖类结构解析

1．7 本论文研究工作及意义

第二章 Alternaria sp．L1α-L-鼠李糖苷酶对抗肿瘤药物的鼠李糖基化修饰

2．1 材料和方法

2．1．1 菌株、质粒和培养基

2．1．2 主要试剂和仪器

2．1．3 α-L-鼠李糖苷酶RhaL1在毕赤酵母中的重组表达及纯化

2．1．4 α-L-鼠李糖苷酶RhaL1对临床抗肿瘤药物的鼠李糖基化修饰

2．1．5 鼠李糖基化修饰糖产物的纯化及分析

2．2 结果

2．2．1 RhaL1对羟基脲的鼠李糖基化修饰

2．2．2 RhaL1对5-氟-2'-脱氧脲核苷的鼠李糖基化修饰

2．3 讨论

本章小结

第三章 Alternaria sp．L1 α-L-鼠李糖苷酶RhaL1的分子改造

3．1 材料和方法

3．1．1 菌株、质粒和培养基

3．1．2 主要试剂和仪器

3．1．3 DNA操作技术

3．1．4 突变酶的毕赤酵母表达

3．1．5 α-L-鼠李糖苷酶的酶活测定

3．1．6 突变酶Y316F的毕赤酵母重组表达载体的构建

3．1．7 突变酶Y316F的毕赤酵母重组表达及纯化

3．1．8 重组表达突变酶Y316F的酶学性质

3．1．9 突变酶Y316F对糖苷合成的催化

3．2 结果

3．2．1 α-L-鼠李糖苷酶RhaL1的活性位点分析

3．2．2 突变酶筛选和表达

3．2．3 突变酶活性测定

3．2．4 突变酶酶Y316F在毕赤酵母中的重组表达及纯化

3．2．5 突变酶Y316F的酶学性质

3．2．6 突变酶Y316F与原始酶催化合成鼠李糖基化产物的效率比较

3．3 讨论

本章小结

附录

参考文献

致谢