新型免疫调节分子Tim-3在围产期缺氧缺血性脑损伤中的作用及其分子机制

摘要

围产期缺氧缺血性脑病(perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是导致儿童残疾的最重要的疾病。因此缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)的机制研究已成为当今医学研究的重要课题之一。其发病机制主要包括有兴奋性氨基酸中毒、氧自由基、钙超载、免疫炎症反应等。虽然有关缺血性脑细胞死亡的兴奋性毒性和氧化胁迫以及细胞凋亡方面的研究已经取得一定进展，但HIE的临床治疗效果仍不理想。近年来脑缺氧缺血再灌注导致的炎症免疫损伤机制日益受到人们的关注。由缺氧缺血再灌注诱导的过度炎症反应是导致脑组织损伤的主要原因之一。
　　Tim-3(T cell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule-3)是一种新型免疫调节因子，已被发现表达于多种免疫细胞上，在固有免疫和适应性免疫中均发挥重要得调节作用。表达于Th1细胞表面的Tim-3与其配体galectin-9一起，可抑制免疫反应，诱导Th1细胞凋亡。Tim-3与巨噬细胞M1/M2的极化、移植免疫耐受、肿瘤免疫反应等多种免疫调节过程相关。Tim-3在免疫炎症相关疾病中已显示出潜在的治疗作用，但有关其在HIBD中作用及机制的研究尚属首次。
　　本研究利用动物模型和体外细胞模型，通过正反双向论证，对Tim-3在围产期HIBD中的作用进行系统的研究。研究发现:1、缺氧缺血刺激促进脑内Tim-3表达显著升高，并主要集中于活化的小胶质细胞。给予新生小鼠缺氧缺血刺激，通过病理组织学分析、凋亡检测等方法判断神经元损伤程度;利用RT-PCR、Western Blot、免疫组织化学染色及激光共聚焦技术检测脑内Tim-3的表达及细胞定位。结果显示，HIBD组小鼠脑内缺血敏感区Tim-3表达显著上调，活化小胶质细胞是脑内Tim-3的主要来源。2、Tim-3对小胶质细胞功能的调控机制研究。本研究分别利用Tim-3过表达质粒及小干扰RNA在BV2细胞系上构建Tim-3过表达、敲减、阻断模型，研究Tim3对缺氧缺血再复灌介导的小胶质细胞分泌炎性细胞因子及NO功能的影响。研究发现，Tim-3可通过NF-κB途径，增强小胶质细胞中TNF-α，IL-1β等促炎因子及iNOS的表达，介导缺氧缺血再灌注后脑内的炎症反应。3、特异性阻断Tim-3的作用可对HIBD损伤神经元产生保护作用。我们利用Tim-3阻断性抗体及Tim-3mut小鼠特异性阻断Tim-3的作用，通过病理组织学分析、凋亡检测等方法判断神经元损伤程度;利用水迷宫及旷场实验，检测小鼠运动及空间学习记忆能力。研究发现，特异性阻断Tim-3的作用可显著减轻缺氧缺血刺激后小鼠脑内的炎症反应，对神经元产生保护作用。
　　本研究的实施与完成，首次揭示新型免疫调节分子Tim-3在围产期缺氧缺血性脑损伤中的作用及其分子机制，为新生儿缺氧缺血性脑病的病理机制研究及临床治疗策略提供了新的思路，具有重要的理论研究及临床应用价值。
　　目的:
　　本研究利用HIBD动物模型和体外细胞模型，以缺氧缺血再灌注过程中，激活的脑内小胶质细胞为研究对象，探讨该病理过程中Tim-3的表达，及其对小胶质细胞功能的调节，深入探讨Tim-3在缺氧缺血诱导的脑内炎症反应及缺血缺氧敏感神经元死亡中发挥的作用及其分子机制。
　　方法:
　　1、Tim-3表达与HIBD损伤程度相关性研究:
　　1)HIBD动物模型构建方法:新生7天C57小鼠结扎右侧颈总动脉，8％氧气环境下缺氧1.5小时，3天后灌流取脑。
　　2)Western Blot、RT-PCR、免疫荧光方法检测HIBD动物模型中Tim-3表达。
　　3)RT-PCR方法检测HIBD动物模型中TNF-α等细胞因子及iNOS表达量。
　　4)HE、TUNEL方法检测脑损伤程度。
　　2、Tim-3对小胶质细胞调控机制的研究:
　　2.1、OGD/R刺激BV2细胞后Tim-3的表达及细胞因子的分泌:
　　1)OGD/R模型构建:给予BV2细胞不含葡萄糖和血清的1640培养基，1％氧气环境下培养3h，更换正常培养基，在正常培养条件下复氧36h。
　　2)Western Blot、RT-PCR、免疫荧光方法检测Tim-3表达。
　　3)RT-PCR方法检测TNF-α等细胞因子及iNOS表达量。
　　2.2、Tim-3对BV2分泌细胞因子的影响:
　　1)构建BV2细胞Tim-3过表达、敲减及抗体阻断模型，给予OGD/R刺激。
　　2)RT-PCR方法检测TNF-α等细胞因子及iNOS表达量。
　　3)ELISA检测细胞上清中TNF-α等细胞因子及NO含量。
　　2.3、Tim-3下游部分信号通路:
　　构建BV2细胞Tim-3过表达、敲减模型，给予0GD/R刺激，Western Blot检测Tim-3下游信号通路相关蛋白的表达。
　　3、阻断Tim-3对HIBD损伤神经元的保护作用:
　　1)HIBD模型构建成功后，给予Tim-3阻断抗体5mg/kg腹腔注射，连续3天，对照组给予同型IgG抗体。同时应用Tim-3mut小鼠构建动物模型。3天后灌流取脑。
　　2)TUNEL方法检测小鼠脑损伤程度。
　　3)RT-PCR方法检测小鼠脑内TNF-α等细胞因子及iNOS表达量。
　　4)Tim-3mut组小鼠及其对照组野生型小鼠构建HIBD模型，饲养到4周，进行水迷宫及旷场实验，检测小鼠运动及空间学习记忆能力。
　　结果:
　　1、Tim-3表达与HIBD损伤程度相关性研究:
　　1)HIBD动物缺血侧脑内大脑皮层、海马及纹状体等缺血敏感区Tim-3表达升高，炎性细胞因子及iNOS的mRNA表达量也均升高。
　　2)Tim-3阳性细胞与CD11b阳性细胞几乎完全重合，提示HIBD动物模型中，Tim-3主要来源于活化的小胶质细胞。
　　2、Tim-3对小胶质细胞调控机制的研究:
　　1)在BV2细胞Tim-3过表达、敲减及抗体阻断模型中，TNF-α等炎性细胞因子及NO的分泌量随Tim-3表达量改变而改变。
　　2)NF-κB磷酸化程度随Tim-3表达量改变而改变。
　　3、阻断Tim-3对HIBD损伤神经元的保护作用:
　　1)给予Tim-3阻断抗体或应用Tim-3敲基因鼠构建HIBD模型后，小鼠脑内缺血敏感区TUNEL阳性细胞明显减少。
　　2)给予Tim-3阻断抗体或应用Tim-3敲基因鼠构建HIBD模型后，小鼠脑组织中TNF-α等炎性细胞因子及iNOS的mRNA表达量降低。
　　3)Tim-3mut组小鼠学习记忆能力较野生型小鼠显著提高。
　　结论:
　　1、在围产期缺氧缺血性脑损伤中，缺血敏感区如大脑皮层、海马及纹状体区Tim-3的表达增加，可能是导致选择性神经元凋亡的重要原因之一。
　　2、活化的小胶质细胞是脑内Tim-3的主要来源。Tim-3可通过NF-κB途径，增强小胶质细胞中TNF-α，IL-1β等促炎因子及iNOS的表达，介导缺氧缺血再灌注后脑内的炎症反应。
　　3、特异性阻断Tim-3的作用后，对围产期缺血缺氧再灌注损伤神经元可产生保护作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

一、圈产期缺氯缺血性脑病

二、HIE中小胶质细胞的作用

三、新型免疫调节分子Tim-3及其作用

第一部分 Tim-3在HIBD动物模型中的表达及定位

1、技术路线

2、材料

3、方法

4、结果

5、讨论

6、结论

第二部分 Tim-3对小胶质细胞调控机制的研究

1、技术路线

2、方法

3、结果

4、讨论

5、结论

第三部分 阻断Tim-3对HIBD损伤神经元的保护作用

1、技术路线

2、方法

3、结果

4、讨论

5、结论

参考文献

硕士期间发表论文

致谢