粘球菌中mts基因簇调控胞外多糖产生及细胞表面粘附力的分子机制的研究

摘要

粘球菌是拥有复杂细胞行为的革兰氏阴性滑动细菌，曾一度被认为是陆生细菌。本实验室经过长期研究发现在海洋环境中也存在大量粘球菌，并分离获得了一株典型的海洋耐盐粘球菌Myxococcus fulvus HW-1，该菌株在海水的刺激下S运动加强。S运动的加强能够增进细胞之间的粘连性，可促使细胞粘附在固体介质上进而避免在潮汐过程中被海水冲走。相关的机制分析有助于我们深入了解粘细菌的起源和进化。
　　前期的实验表明mts基因簇可能参与了上述机制。mts基因簇由6个基因组成，分别是mtsA至mtsF。在粘球菌的模式菌株Myxococcus xanthus DK1622中含有6个与其高度同源的基因，分别是MXAN1332至MXAN1337。生物信息学分析表明:mtsB、mtsC、MXAN_1333和MXAN_1334基因编码的蛋白均含有一个能与钙离子结合的结构域;mtsD，mtsE，MXAN1335和MXAN1336基因编码的蛋白均含有一个vWFA(von Willebrand Factor)结构域。凝血初期时该复合物在血小板粘附过程中发挥着十分重要的功能。结合有Ca2+离子的TSP(Thrombospondin)能够作用于vWF的A3结构域，进而破坏该结构域中的二硫键，使vWF的巯基显露出来继而行使凝血功能。鉴于以上的分析，我们提出这样一种假说:MtsB和MtsC蛋白在二价阳离子(例如Ca2+、Mg2+)信号的刺激下作用于MtsD/MtsE蛋白，并将信号传递出去。
　　由于海水中二价阳离子主要为Ca2+和Mg2+，因此我们采用钙盐和镁盐的水溶液来代替海水，比较在相同浓度的二价阳离子作用下，M.fulvus HW-1菌株的S运动是否仍然增强。实验结果表明，在相同浓度的二价阳离子作用下，M.fulvusHW-1菌株的S运动有一定程度的增强，但是效果没有海水刺激下的明显。
　　因为在M.fulvus HW-1中缺乏有效的遗传操作手段，所以后面的实验都是在模式菌株M.xanthus DK1622中展开的。接下来我们在M.xanthus DK1622中构建了分别敲除MXAN_1333/MXAN_1334基因的菌株，及回补相应mtsB/mtsC基因的菌株，细胞表面的粘附能力实验表明，回补了mtsB、mtsC的菌株的表面粘附能力比没有回补的菌株要强，由此可知基因mtsB、mtsC的回补能增强细胞表面的粘附能力，进一步的实验表明该增强过程是通过蛋白MXAN_1335和MXAN1336来实现的，且这两个基因的蛋白可能是同功蛋白。
　　实验室前期研究发现mts基因簇中的基因编码的蛋白能调控pilB和pilT基因编码的蛋白。由于这两个基因是控制四型菌毛伸长和收缩的两个关键基因，因此mts基因簇有可能是通过调控细胞表面处于伸长状态下的菌毛的数量来调控粘球菌的S运动。同时我们还发现，在海水的刺激下不仅是菌体表面菌毛的数量增多，EPS的产量也相应增多。这两者之间是否有必然的联系呢？我们在上述菌株的基础上构建了敲除pilA基因的菌毛缺失突变株，通过EPS定量实验发现菌毛缺失突变株在海水的刺激下EPS产量仍然增多，这表明粘球菌中存在不依赖于菌毛的其他EPS调控途径。
　　那么mts基因簇是如何调控EPS产量的呢？结合相关文献报道，我们猜测mts基因簇通过参与Dif信号系统来调控EPS的产量。Dif信号系统是调控EPS产生的一个信号路径，由6个基因组成。其中difA、difC、difE是EPS产生的三个必须基因，缺失任何一个，EPS都将是缺陷的。为了验证我们的假设，我们在敲除difA基因的基础上回补了mts基因簇，发现该菌株在海水的刺激下EPS的产量与野生菌株相当。但difC基因缺失突变后，EPS产生了缺陷。Mts复合物似乎能够绕过DifA蛋白而直接作用于其下游的DifC蛋白，进而调控EPS的产生。酵母双杂交实验再次证明了该过程，MtsF与DifC之间存在相互作用。
　　结合实验室前期的酵母双杂交实验结果，我们推测mts基因簇编码的蛋白是以两两相互作用的蛋白复合体形式存在，而与DifC、PilB、PilT同时有相互作用的唯有MtsF，所以我们推测mts基因簇在接受海水等信号以后是通过MtsF将信号传递出去，进而调控EPS的产生及S运动。蛋白荧光定位实验也显示，MtsF蛋白确实大部分都分布于细胞的两端，与PilB、PilT的定位类似。

目录

声明

摘要

符号说明及缩写词

第一章 文献综述

1．1 粘细菌中的滑行运动

1．2 粘细菌的双运动系统

1．2．1 粘细菌的A运动系统

1．2．2 粘细菌的S运动系统

1．3 粘细菌的发育过程

1．4 海洋耐盐粘细菌

1．5 mts基因簇的发现

1．5．1 耐盐粘细菌HW-1的突变株HL-1的获得

1．5．2 mts基因簇及其同源基因的序列分析

1．5．3 Myxococcus xanthus DK1622中mts同源基因缺失突变株的构建

1．6 本论文研究思路及内容

第二章 mts应答海水增强细胞表面粘附力的机制分析

2．1 实验材料

2．1．1 菌株及质粒

2．1．2 培养基

2．1．3 实验试剂

2．1．4 仪器耗材

2．2 实验方法

2．2．1 mts基因簇的生物信息学分析

2．2．2 钙荧光白染色法检测菌株的EPS产生能力

2．2．3 菌株的S运动能力分析

2．2．4 mts与epsA双敲除突变株的构建

2．2．5 mts回补菌株的构建

2．3 实验结果和分析

2．3．1 mts基因簇结构域及信号肽预测

2．3．2 不同二价阳离子条件下HW-1菌株的EPS产量及S运动能力分析实验结果

2．3．3 各突变株的粘附能力实验结果

2．4 本章小结

第三章 mts基因簇可直接调控EPS的产生进而调控S运动

3．1 实验材料

3．1．1 菌株及质粒

3．1．2 培养基

3．1．3 实验试剂

3．1．4 仪器耗材

3．2 实验方法

3．2．1 mts与pilA双敲除突变株的构建

3．2．2 回补菌株的构建

3．2．3 菌株的EPS产生能力分析-染料结合法

3．2．4 菌株的EPS产生能力分析-钙荧光白染色法

3．2．5 社会性发育能力分析

3．2．6 菌株的S运动能力分析

3．3 实验结果及分析

3．3．1．mts同源基因缺失及其回补菌株细胞表面EPS产生能力分析

3．3．2 mts同源基因及pilA基因双缺失突变菌株及其回补菌株的EPS的产生能力分析

3．3．3 mts基因参与的信号路径分析

3．4 本章小结

第四章 MtsF在细胞中的定位分析

4．1 实验材料

4．1．1 菌株和质粒

4．1．2 培养基

4．1．3 实验试剂

4．1．4 仪器耗材

4．2 实验方法

4．2．1 目的蛋白和荧光蛋白融合表达载体的构建

4．2．2 目的蛋白和荧光蛋白融合表达菌株的构建

4．2．3 荧光的检测

4．3 实验结果与分析

4．3．1 重组质粒构建结果

4．3．1 荧光观察结果

4．4 本章小结

总结与展望

附录

参考文献

致谢