脂肪间充质干细胞外泌体对巨噬细胞极化的调节及其在饮食诱导肥胖中的作用

摘要

研究背景和目的
　　肥胖是由于能量摄入大于消耗导致脂肪在体内过度堆积而形成的一种慢性代谢性疾病。众所周知，肥胖可以诱发胰岛素抵抗、高血糖、高血压、高血脂等一系列代谢综合征，并进一步导致Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化等心血管疾病甚至癌症的发生。近年来，由于饮食结构以及生活方式的改变，肥胖在全世界的发病率逐年升高，已经发展为严重影响人类健康的疾病。因此针对肥胖的干预治疗是预防和治疗肥胖相关疾病的重要措施。
　　巨噬细胞是脂肪组织中的重要免疫细胞。目前认为巨噬细胞可分为两种亚型，一种是经典活化的M1型巨噬细胞，介导炎症反应;另一种是选择性活化的M2型巨噬细胞，具有抑制炎症的作用。有研究证实，正常的腹内白色脂肪组织中以M2巨噬细胞为主，参与维持脂肪组织的免疫稳态;而随着肥胖的发生，白色脂肪组织中浸润的巨噬细胞则以M1巨噬细胞为主，介导脂肪组织炎症的发生发展。由于脂肪组织炎症是胰岛素抵抗和代谢综合征发生的关键因素，因此调控巨噬细胞的活化是抑制脂肪组织炎症、控制肥胖相关代谢紊乱的重要措施。
　　脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived stem cell，ADSC)，是存在于脂肪组织中的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)，具有多向分化潜能，是目前组织修复和再生领域的研究重点和热点。我们的前期工作中证实，ADSC可促进巨噬细胞向M2方向极化，进而抑制肥胖诱发的脂肪组织炎症，增强肥胖小鼠对胰岛素的敏感性。但ADSC影响巨噬细胞向M2型极化的机制尚不清楚。
　　外泌体(exosome)是由细胞分泌的直径约在30-150nm大小的囊泡样结构小体，内含有多种具有生物学活性的蛋白质和RNA，参与细胞之间信息的交流与传递。因来源的细胞不同，外泌体的成分和功能也有所不同。有研究证实，外泌体不但可以作为肿瘤等疾病的生物学诊断标志物，在疾病的治疗中也起到重要作用。MSC因在维持机体稳态中起重要作用，故针对MSC来源外泌体的研究也得到了大家的广泛关注。但针对ADSC来源外泌体的研究少有涉及，而ADSC来源外泌体对巨噬细胞极化的调节以及在饮食诱导肥胖中的作用尚无研究。
　　为了明确ADSC来源外泌体在调节巨噬细胞以及饮食诱导肥胖中的作用，我们进行了以下实验研究，通过高脂饮食喂养建立小鼠肥胖模型，并用ADSC来源外泌体对肥胖模型小鼠进行干预，证实了ADSC来源外泌体可以抑制高脂饮食小鼠的脂肪组织炎症和代谢紊乱，并减缓其肥胖的进展;此外，我们的研究亦证实ADSC来源外泌体可以促进巨噬细胞向M2方向极化，进而抑制肥胖相关脂肪组织炎症并延缓肥胖的进展。这为肥胖的干预治疗提供了新的思路与方向。
　　方法：
　　一、ADSC的分离扩增和培养
　　取10-12周龄的C57BL/6雄性小鼠的附睾处脂肪组织，将组织剪碎后加入Ⅰ型胶原酶，37℃摇床中消化45分钟。过滤离心后，把得到的血管基质成分（stromal vascular fraction，SVF）接种到六孔板中进行培养扩增，24小时后换液以去除悬浮细胞。当细胞达到80％融合度时，可进行细胞传代。传代后梭形的贴壁细胞即为ADSC。取第四代细胞进行后续实验。
　　二、小鼠腹腔巨噬细胞的获取
　　取6-8周龄的C57BL/6雄性小鼠，腹腔注射1ml6％无菌淀粉溶液，72小时后麻醉后处死小鼠，用无血清的DMEM培养基灌洗腹腔，收集腹腔灌洗液，过滤离心后，用含有10％血清的培养基重悬巨噬细胞，计数，接种于12孔板或者6孔板中，过夜培养后可用于后续实验。
　　三、ADSC来源外泌体的提取与鉴定
　　用去除外泌体的培养基培养ADSC，取第四代ADSC的培养上清，过滤离心后，取上室浓缩液于新的无菌的15ml离心管中，加入Exoquick-TCTM外泌体提取试剂提取外泌体，无菌PBS重悬沉淀并分装，-80℃冷冻保存。
　　将提取的外泌体分别用纳米粒度分析仪、透射电镜的方法对其大小以及形态进行检测，用Western-blot的方法检测外泌体标志TSG101、CD9、CD63、HSP90的表达。
　　四、体外研究ADSC来源外泌体对巨噬细胞的影响
　　ADSC来源外泌体与小鼠腹腔巨噬细胞共孵育，用荧光定量PCR的方法检测巨噬细胞M1相关表型诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素12（interleukin-12，IL-12），以及M2相关表型精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）、白介素10(interleukin-10，IL-10)的mRNA表达水平。Western-blot检测Arg-1的表达变化。
　　用LPS和IFN-γ联合刺激经外泌体孵育过的巨噬细胞，用荧光定量PCR的方法检测巨噬细胞中iNOS、TNF-α、IL-12的mRNA表达水平。用ELISA的方法检测巨噬细胞中炎性因子TNF-α、IL-12的蛋白表达水平。
　　五、小鼠肥胖模型的建立及ADSC来源外泌体干预治疗
　　C57BL/6雄性小鼠在8周龄时给予60％高脂饲料喂养20-26周，以建立饮食诱导肥胖模型，对照组小鼠采用常规饲料喂养。在高脂饮食喂养末期，对小鼠进行为期6-8周的外泌体干预治疗（腹腔注射，30μg/小鼠，每3天注射一次）。
　　六、ADSC来源外泌体干预对小鼠肥胖的影响
　　在高脂饮食喂养期间，每周对各组实验小鼠进行称重，并于外泌体干预期间监测小鼠摄食量的变化。外泌体干预结束后，称量各组小鼠的体重，观察外泌体干预治疗对肥胖小鼠体重的影响。麻醉后处死小鼠，取其附睾处白色脂肪组织、皮下白色脂肪组织以及棕色脂肪组织进行称重，计算各部位脂肪组织重量占体重的百分比，并进行统计分析。
　　七、ADSC来源外泌体干预对小鼠代谢参数的影响
　　ADSC来源外泌体治疗过程中或治疗后，分别对实验小鼠进行葡萄糖耐量实验(glucose tolerance test，GTT)、胰岛素耐量实验(insulin glucose tolerance test，ITT)检测，以及检测血清中甘油三酯(triglyceride，TG)和总胆固醇(totalcholesterol，TC)的变化。
　　八、ADSC来源外泌体干预对小鼠白色脂肪组织米色化的影响
　　外泌体干预结束后，取小鼠附睾处以及皮下脂肪组织，Trizol法抽提RNA后，用荧光定量PCR的方法检测棕色脂肪UCP1、PGC1α，米色脂肪标志TBX1、TMEM26的mRNA水平的表达。Western-blot的方法检测UCP1在蛋白水平的表达。
　　九、ADSC来源外泌体干预对脂肪组织炎症及巨噬细胞活化的影响
　　取小鼠附睾处白色脂肪组织，ELISA检测附睾处脂肪组织块培养上清中TNF-α、IL-10的表达;荧光定量PCR检测小鼠附睾处白色脂肪组织SVF中TNF-α、IL-6、IL-12等的表达;流式细胞术检测小鼠附睾处白色脂肪组织SVF中F4/80、Arg-1的表达。
　　结果：
　　一、ADSC来源外泌体促进巨噬细胞向M2型极化
　　将ADSC来源外泌体作用于小鼠腹腔巨噬细胞，荧光定量PCR结果显示，外泌体刺激显著上调巨噬细胞M2相关表型Arg-1、IL-10的mRNA表达水平，而其M1相关表型iNOS、TNF-α、IL-12的mRNA表达水平则无明显变化。Western-blot结果显示，外泌体孵育后巨噬细胞中Arg-1的蛋白表达水平明显升高。此外，将经外泌体孵育的巨噬细胞用LPS和IFN-γ进行联合刺激，发现外泌体孵育的巨噬细胞对LPS和IFN-γ刺激的反应性明显降低，其iNOS、TNF-α和IL-12的表达水平较未经外泌体孵育的巨噬细胞有显著下调。以上结果提示ADSC来源外泌体可促进巨噬细胞的M2极化，进而抵抗LPS和IFN-γ诱导的巨噬细胞炎症反应。
　　二、ADSC来源外泌体抑制肥胖小鼠的体重增加
　　将高脂喂养的肥胖模型小鼠分为外泌体干预组(HFD-exosome)和生理盐水组(HFD-NS)，以常规饮食喂养的小鼠注射生理盐水作为对照组(NCD-NS)。外泌体干预结束后，对小鼠体重及其小鼠附睾处白色脂肪组织、皮下白色脂肪组织、棕色脂肪组织称重发现，高脂喂养导致小鼠体重及白色脂肪组织重量明显增加，而外泌体干预治疗后，小鼠的体重以及各个部位的白色脂肪组织重量较HFD-NS组均明显下降。
　　三、ADSC来源外泌体改善高脂喂养小鼠的代谢紊乱
　　GTT和ITT结果显示，相对于HFD-NS组的小鼠，HFD-exosome组小鼠对葡萄糖的耐受性和对胰岛素的敏感性都有明显的改善，且在多个时间点上均具有统计学差异。试剂盒检测血清中甘油三酯和胆固醇的水平发现，高脂饮食喂养后，肥胖小鼠血清中甘油三酯和胆固醇的水平明显上调，而外泌体干预治疗后血清甘油三酯和胆固醇的水平则明显下调。
　　四、ADSC来源外泌体促进高脂喂养小鼠的白色脂肪米色化
　　外泌体干预结束后，取小鼠附睾处以及皮下白色脂肪组织进行荧光定量PCR。结果显示，HFD-exosome组中附睾处和皮下白色脂肪组织中棕色及米色脂肪细胞标志基因UCP1、PGC1α、TBX1、TMEM26的表达量较HFD-NS组均有不同程度的升高。Western-blot结果显示，与HFD-NS组相比，HFD-exosome组小鼠的附睾处以及皮下白色脂肪组织中UCP1的蛋白水平明显升高。由此可以看出，ADSC来源外泌体可以促进高脂喂养小鼠的白色脂肪米色化。
　　五、ADSC来源外泌体促进白色脂肪组织中巨噬细胞的M2极化并抑制白色脂肪组织炎症
　　附睾处白色脂肪组织的体外培养结果显示，外泌体干预治疗后，小鼠附睾处白色脂肪组织分泌的促炎细胞因子TNF-α较HFD-NS组明显降低，而抑炎细胞因子IL-10的表达水平则明显升高。同时，荧光定量PCR检测结果显示，高脂喂养的肥胖小鼠附睾处白色脂肪组织SVF中TNF-α、IL-12和IL-6的mRNA水平较NCD-NS组均有不同程度的升高，而外泌体干预则可显著降低以上炎性细胞因子的表达。相反，外泌体干预治疗可明显上调高脂喂养小鼠SVF中M2相关Arg-1的mRNA水平。流式结果亦显示，外泌体干预治疗可明显上调高脂喂养小鼠白色脂肪组织中巨噬细胞的Arg-1表达水平。以上结果表明，外泌体干预可促进脂肪组织中巨噬细胞向抗炎M2巨噬细胞极化，并抑制白色脂肪组织炎症。
　　结论：
　　一、ADSC来源外泌体可促进巨噬细胞向M2型的极化。
　　二、ADSC来源外泌体干预治疗可抵抗饮食诱导肥胖的进展。
　　三、ADSC来源外泌体可以改善饮食诱导肥胖小鼠的代谢紊乱。
　　四、ADSC来源外泌体干预治疗可抑制肥胖诱发的脂肪组织炎症。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

实验材料

实验方法

一、细胞培养

二、ADSC来源外泌体的提取、鉴定与标记

三、ADSC来源外泌体对巨噬细胞的作用

四、小鼠饮食诱导肥胖模型的建立与ADSC来源外泌体的干预

五、ADSC来源外泌体对高脂饮食小鼠体重的影响

六、ADSC来源外泌体对高脂饮食小鼠代谢参数的影响

七、ADSC来源外泌体对高脂饮食小鼠白色脂肪组织的影响

八、ADSC来源外泌体对白色脂肪组织炎症的影响

九、常用检测方法

十、统计学分析方法

结果

一、ADSC来源外泌体对巨噬细胞的作用

二、ADSC来源外泌体可减缓高脂饮食小鼠的体重增加

三、ADSC来源外泌体可改善高脂饮食小鼠的代谢紊乱

四、ADSC来源外泌体可以抑制白色脂肪细胞的肥大，促进米色脂肪细胞基因的表达

五、ADSC来源外泌体可促进白色脂肪组织中巨噬细胞的M2极化并抑制白色脂肪组织炎症

讨论

结论

附表

附图

参考文献

致谢

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