应用模型细胞膜探究二氧化硅纳米颗粒对细胞膜结构和相态的影响

摘要

纳米二氧化硅是使用量最多的纳米材料之一，具有较高的化学稳定性，在制药、医疗、生物科技等方面具有广泛应用，这增加了生物体与其接触的机会。有研究报导尘肺病等疾病的产生与长期接触二氧化硅纳米颗粒(SiO2 NP)有关，但是其致病机理仍不明确。SiO2 NP与细胞膜的直接接触是导致细胞毒性的重要途径。因此，本论文对SiO2 NP与细胞膜的相互作用进行了深入研究。
　　细胞膜结构的完整性和相态的流动性是细胞进行正常生命活动的必要条件，本论文基于细胞膜这两个与功能相关的结构特点探究了纳米颗粒对细胞膜完整性和相态流动性的影响。由于细胞的代谢活动会干扰对纳米颗粒与细胞膜界面作用的认识，本论文采用人工生物膜——大单层囊泡(GUV)和小单层囊泡(SUV)作为细胞膜模型，研究不同分散状态以及表面修饰的SiO2 NP对细胞膜的影响。此外，本论文还从RBL-2H3细胞中提取了质膜囊泡(GPMV)作为介于真实细胞膜和人工生物膜之间的细胞膜模型，从分子水平讨论了纳米颗粒改变细胞膜相态的机理，进一步完善了关于纳米颗粒与细胞膜界面作用的认识，为纳米材料的安全使用提供重要信息。
　　1.SiO2等纳米氧化物对模拟细胞膜结构和流动性的影响
　　本研究比较了SiO2 NP及其它四种常用的纳米氧化物Al2O3、Fe2O3、TiO2、ZnO与模拟细胞膜的界面作用。实验结果表明，在静电作用下Al2O3和SiO2 NP破坏了带有相反电性的细胞膜完整性。然而Fe2O3、TiO2和ZnO NP并没有对细胞膜造成明显的破坏。将相态指示探针Laurdan加入模拟细胞膜中，其荧光光谱表明SiO2 NP能够使细胞膜向胶态化转变。而Al2O3和ZnO NP仅使电性相反的细胞膜向胶态化转变。通过傅里叶红外光谱技术(FT-IR)探究纳米颗粒对磷脂分子结构的影响，结果表明Al2O3和SiO2 NP会结合磷脂分子的羰基或者磷酸基团形成氢键。其中，SiO2 NP与细胞膜之间的氢键作用更强。因此，氢键作用使Al2O3和SiO2 NP破坏了细胞膜的结构，改变了细胞膜的相态。
　　2.不同分散状态和表面修饰的SiO2 NP对磷脂层的影响
　　由于SiO2 NP对细胞膜造成的损伤更为严重，选取不同分散状态及表面修饰的SiO2 NP，深入探讨了SiO2 NP对模拟细胞膜GUV结构和相态的影响。研究发现静电吸引促进颗粒与磷脂分子之间形成氢键，几种不同的SiO2 NP均对相反电性GUV的形态破坏更严重，但对电性相同的GUV破坏作用较弱。增加SiO2 NP的暴露时间和剂量加剧了膜损伤。此外，由于纳米颗粒易沉积增大了颗粒物与GUV的接触机率，快速沉降的SiO2 NP粉末对GUV破坏程度要强于稳定分散的SiO2 NP胶体。相态指示探针Laurdan的荧光光谱表明负电的SiO2 NP引起细胞膜的胶态化;而经过表面修饰带正电的SiO2 NP对正电性和电中性的GUV的相态影响不明显，但是能够使电负性的GUV向胶态移动。
　　3.SiO2 NP吸附腐殖酸和蛋白质后对细胞膜的影响
　　SiO2 NP排放进入环境后会带来健康风险。SiO2 NP在自然界中容易吸附腐殖酸(HA)等天然有机物，在人体体液中则容易吸附蛋白质等生物分子，这会改变颗粒的表面性质和生物毒性，从而影响SiO2 NP与细胞膜之间的相互的作用。因此牛血清蛋白(BSA)和腐殖酸被用来处理SiO2 NP(BSA-SiO2 NP和HA-SiO2NP)，探究吸附BSA或HA后的SiO2 NP对模拟细胞膜完整性和相态的影响。显微观察表明，与裸颗粒相比BSA-和HA-SiO2 NP对GUV的破坏作用较慢，而BSA-SiO2 NP对GUV的破坏作用最弱。这是因为BSA和HA覆盖了SiO2 NP表面的Si-OH以及SiO-，从而减弱了SiO2 NP与磷脂分子之间的相互作用。石英晶体微天平测定表明BSA-SiO2 NP吸附在未破裂的SUV表面，而HA-SiO2 NP和裸颗粒则迅速引起SUV破裂。吸附BSA和HA后的SiO2 NP对细胞膜相态的改变不同于裸颗粒，其中HA-SiO2 NP使细胞膜胶态化最显著，而BSA-SiO2 NP对细胞膜的相态影响最弱。因此，蛋白质能够有效地减弱SiO2 NP对细胞膜完整性和相态的影响。
　　4.SiO2 NP对质膜囊泡相态的影响
　　由于人工生物膜的组成成分与真实细胞膜存在差异，本论文从RBL-2H3细胞中提取质膜囊泡作为介于真实细胞膜和人工生物膜之间的细胞膜模型，并研究细胞膜分子组成在SiO2 NP改变细胞膜相态过程中的作用。研究发现，用甲基-β-环糊精去除膜内胆固醇的GPMV与SiO2 NP接触后，膜相态向胶态移动更显著。实验使用PFA/DTT和NEM两种起泡剂刺激细胞起泡制备磷脂组成不同的GPMV。其中PFA/DTT起泡剂会减少细胞膜中的脑磷脂(PE)和磷酸肌醇(PI)的含量，NEM起泡剂制备的GPMV磷脂组分接近原细胞膜。实验结果表明，去除PE和PI的GPMV暴露在SiO2 NP中其相态向胶态化转变更显著。此外，温度升高时GPMV受SiO2 NP影响后胶态化更严重。
　　由于细胞生命活动需要隔离的胞内空间和流动态的细胞膜来支持膜蛋白并控制物质进出，对细胞膜完整性和流动性的破坏很可能是细胞毒性的重要机制。同时全面了解SiO2 NP与细胞膜的界面作用，对设计更安全的纳米材料有一定的指导价值。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 纳米颗粒的性质及应用

1．1．1 纳米颗粒的特殊性质

1．1．2 SiO2 NP的应用和环境过程

1．2 SiO2 NP的生物效应

1．2．1 SiO2 NP对水生生物以及微生物的毒性影响

1．2．3 引发SiO2 NP毒性效应的因素

1．3 SiO2 NP对细胞膜的损伤

1．3．1 SiO2 NP对细胞膜结构完整性的影响

1．3．3 影响SiO2 NP与细胞膜界面作用的机制

1．4 细胞膜模型

1．4．1 人工生物膜

1．4．2 质膜囊泡

1．5 研究意义及研究内容

1．5．1 研究意义

1．5．2 研究内容

参考文献

第二章 二氧化硅等纳米氧化物对磷脂膜完整性和流动性的影响

2．1 实验材料和方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 囊泡的制备

2．1．3 五种纳米氧化物的表征

2．1．4 囊泡暴露实验

2．1．5 傅里叶红外光谱分析(FT-IR)

2．1．6 纳米氧化物对细胞膜相态的影响

2．2 实验结果和讨论

2．2．1 静电作用对Al2O3和SiO2 NP与细胞膜相互作用的影响

2．2．2 Fe2O3、TiO2和ZnO NP对细胞膜形态的影响

2．2．3 纳米氧化物对细胞膜相态的影响

2．2．4 红外光谱法测量纳米氧化物对磷脂分子结构的影响

2．3 小结

参考文献

第三章 不同表面修饰和分散状态的二氧化硅纳米颗粒对磷脂双分子层结构完整性和流动性的影响

3．1 材料和方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 SiO2 NP物理化学性质的表征

3．1．3 囊泡的制备

3．1．4 GUV成像

3．1．5 囊泡暴露实验

3．1．6 SiO2 NP对囊泡相态的影响

3．2 结果和讨论

3．2．2 表面电性、暴露时间和暴露浓度对SiO2 NP与细胞膜之间相互作用的影响

3．2．3 粉末状SiO2 NP与胶态SiO2 NP对细胞膜的影响

3．2．4 荧光光谱测定SiO2 NP对囊泡相态流动性的影响

3．3 小结

参考文献

第四章 牛血清蛋白和腐殖酸对二氧化硅纳米颗粒和细胞膜相互作用的影响

4．1 实验方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 SiO2 NP表征

4．1．3 囊泡的制备

4．1．4 囊泡暴露实验

4．1．5 应用QCM-D对颗粒物与细胞膜相互作用的动态分析

4．1．6 颗粒物对细胞膜相态流动性的影响

4．2 实验结果和讨论

4．2．1 SiO2 NP以及BSA和HA处理的SiO2 NP的表征

4．2．2 SiO2 NP、BSA．和HA-SiO2 NP对囊泡形态的影响

4．2．3 纳米颗粒在囊泡表面沉降动力学实验

4．2．4 SiO2 NP、BSA-和HA-SiO2 NP对囊泡相态流动性的影响

4．3 小结

参考文献

第五章 二氧化硅纳米颗粒对质膜囊泡相态影响的研究

5．1 实验方法

5．1．1 实验材料和方法

5．1．2 细胞培养过程

5．1．3 质膜囊泡的制备

5．1．4 囊泡的制各

5．1．5 荧光光谱扫描实验

5．1．6 显微镜观察实验

5．2 结果和讨论

5．2．2 25℃和37℃下测定SiO2 NP对质膜囊泡相态的影响

5．2．3 胆固醇对SiO2 NP改变质膜囊泡和人工合成膜相态的影响

5．2．4 磷脂分子成分对SiO2 NP改变质膜囊泡相态的影响

5．3 小结

参考文献

第六章 工作总结与展望

6．2 创新点

6．3 工作展望

致谢

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