冰岛硫化叶菌DExD/H-box家族解旋酶SiRe_0681与SiRe_1605的功能分析

摘要

DExD/H-box蛋白指的是一类具有NTP酶活性的，隶属超级族2的DNA或RNA解旋酶，广泛存在于全部的真核生物细胞和大多数的细菌与古菌中，并且在这些物种中都具有很高的保守性。DExD/H-box解旋酶普遍具有9个保守的基序，基序Ⅱ中存在核心的保守氨基酸序列D-E-A-D(asp-glu-ala-asp)，这个基序被认为是ATP的结合位点，ATP水解为解旋酶的解旋活性提供能量，也根据这个基序对整个蛋白家族进行命名。DExD/H-box解旋酶参与许多细胞进程，在核酸代谢过程中起着重要作用，比如参与双链解旋、mRNA前体加工、转录、翻译、以及mRNA降解、基因损伤修复、核糖体生物合成、核糖核蛋白(RNP)复合体重排以及核质运输等。
　　冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)是一种在北半球广泛分布的极端嗜酸嗜热古菌。DExD/H-box解旋酶的存在，对该古菌在极端环境下的生存起着重要作用，但是对DExD/H-box解旋酶的研究仍然很有限。实验室前期研究中，得到了冰岛硫化叶菌中两个DExD/H-box解旋酶SiRe_0681与SiRe_1605的基因敲除型菌株，并分析了体内功能，但是敲除菌株的表型分析不够全面，体外生化实验也尚未进行。本课题尝试对冰岛硫化叶菌中的两个DExD/H-box解旋酶SiRe_0681与SiRe1605进行进一步研究。在古菌体内过表达蛋白，测量生长曲线，并检测敲除菌株在低温环境下的生长速率，探索其体内功能。结合转录组数据分析敲除菌株在有或无MMS损伤剂处理下的转录水平变化，分析SiRe_0681与SiRe_1605在细胞内参与的途径与发挥的功能。并且在大肠杆菌中表达纯化蛋白，初步检测解旋酶活性。
　　将SiRe_0681与SiRe_1605分别在古菌体内过表达，发现对菌株的生长没有明显的影响。但是在60℃的相对低温下，ΔSiRe_0681与ΔSiRe_1605两个敲除型菌株的生长速度都比野生型慢很多，说明DExD/H-box解旋酶对冷胁迫下S.islandicus的生存起着重要作用。之前的研究中发现，ΔSiRe_0681在最适温度75℃下的生长速度比野生型REY15A要快，流式细胞分析表明敲除SiRe_0681可能跳过了一些G1/S期的核酸加工修饰过程，导致细胞进程加快。但是当在相对低温条件下，细胞生长速度却减慢了很多，说明这些SiRe_0681所调节的核酸加工修饰可能对细胞应对低温胁迫有很大帮助，有利于嗜热菌在更广泛的温度中生存。SiRe_1605的缺失同样导致了低温下细胞生长速度的减慢，而且敲除SiRe_1605会导致细胞在MMS损伤剂处理下更容易发生聚集。说明SiRe_1605可能参与基因修复，对于细胞遭受到冷胁迫或者损伤时，都会发挥重要的作用。
　　转录组数据分析发现，MMS处理后ΔSiRe_0681中与细胞分裂相关的基因全部出现上调。反向旋转酶(reverse gyrase)对极端嗜热菌在高温下生存非常重要，反向旋转酶在ΔSiRe_0681中显著上调，在ΔSiRe_1605中却表现出显著下调，说明其对二者在MMS损伤剂处理下分别表现出的生长加快与生长减慢现象有一定的影响。MMS处理后ΔSiRe_1605中与基因修复、DNA复制、转录相关的基因都发生了下调，说明SiRe_1605参与细胞的损伤修复途径，缺失后导致细胞面对损伤压力加大，不得不减慢生长速度来争取时间修复。根据总体转录水平的上下调以及KEGG富集分析发现，敲除SiRe_1605对细胞内的基因表达水平以及代谢通路的影响比敲除SiRe_0681要大，说明SiRe_1605还可能参与许多细胞中的代谢通路以及表达调控过程。
　　在转录组数据分析中发现，由于两个解旋酶SiRe_0681与SiRe_1605的基因敲除，导致一段连续区域的转录水平为0，这种特殊的现象可能与DExD/H-box解旋酶对基因沉默机制的调节有关。
　　在大肠杆菌中表达SiRe_0681，并使用热处理与镍柱亲和层析的方法进行了纯化。SiRe_1605蛋白表达时容易形成沉淀，而且可能会从序列中间起始翻译同时表达多个蛋白，难以纯化。尝试改进表达纯化条件，更换载体，最终得到比较纯的SiRe_1605蛋白。使用三种不同的DNA底物进行活性检测，但是并没有表现出明显的DNA解旋酶活性，考虑到生物信息学预测SiRe_0681与SiRe_1605为RNA解旋酶，而且SiRe_0681在Thermococcus kodakarensis中的同源蛋白TK-dead在体外仅仅能够解旋RNA茎环结构，所以有待进一步检测其RNA解旋酶活性。

目录

声明

摘要

缩略语表

1．1 古菌概述

1．1．1 两域学说与三域学说

1．1．2 古菌的分类

1．1．3 古菌的基本特征

1．2 硫化叶菌概述

1．2．1 硫化叶菌基本特征

1．2．2 硫化叶菌分类

1．2．3 冰岛硫化叶菌

1．2．4 冰岛硫化叶菌表达载体

1．3 DExD／H-box家族解旋酶

1．3．2 DEAD box解旋酶的结构组成

1．3．3 DEAD box解旋酶的功能

1．3．4 古菌中的DExD／H-box解旋酶

1．4 DNA的损伤修复

1．4．1 DNA损伤

1．4．2 研究嗜热菌DNA损伤修复的意义

1．5 转录组学及其应用

1．5．1 转录组概述

1．5．2 转录组测序与高通量测序

1．5．3 转录组学研究意义

1．6 本课题的立题依据与基本思路

1．6．1 立题依据

1．6．2 基本思路

第二章 冰岛硫化叶菌DExD／H-box解旋酶SiRe_0681与SiRe_1605的体内功能分析

2．1 材料与方法

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 培养基

2．1．3 过表达载体的构建

2．1．4 S.islandicus E233S细胞的电转化

2．1．5 古菌转化子纯化与验证

2．1．6 过表达菌株生长曲线测定

2．1．7 敲除菌株在低温下生长曲线测定

2．2 实验结果和讨论

2．2．2 体内过表达SiRe_0681和SiRe_1605

2．2．3 △SiRe_0681和△SiRe_1605在低温条件下生长更慢

2．3 本章总结与讨论

第三章 转录组分析SiRe_0681与SiRe_1605的体内功能以及MMS处理后细胞的损伤应答反应

3．1 材料与方法

3．1．1 样品获取及RNA提取与富集

3．1．2 基因表达量统计

3．1．3 差异表达基因的KEGG富集分析

3．2 实验结果和讨论

3．2．1 验证△SiRe_0681和△SiRe_1605敲除菌株中表达量为0的基因

3．2．2 敲除DExD／H-box解旋酶对基因沉默机制的影响

3．2．3 △SiRe_0681中的转录水平变化

3．2．4 △SiRe_1605中的转录水平变化

3．2．5 Ups操纵子基因的转录水平变化

3．2．6 冰岛硫化叶菌在MMS处理下的损伤应答反应

3．2．7 差异表达基因的KEGG分析

3．3 本章总结与讨论

第四章 SiRe_0681与SiRe_1605的蛋白表达与功能分析

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株与质粒

4．1．2 培养基

4．1．3 表达载体的构建

4．1．4 蛋白表达纯化

4．1．5 Western blot

4．1．6 DNA底物制备与纯化

4．1．7 DNA解旋酶活性的检测

4．2 实验结果与讨论

4．2．2 表达纯化蛋白SiRe_0681

4．2．3 表达纯化蛋白SiRe_1605

4．2．4 DNA解旋酶活性的检测

4．3 本章总结与讨论

5．1 总结

5．2 展望

附录

参考文献

致谢

攻读学位期间参与发表的论文