基于转录组芯片筛选的lncRNAs在婴幼儿血管瘤中的作用及其机制研究

摘要

第一部分:基于转录组芯片的婴幼儿血管瘤组织中长链非编码RNAs(lncRNAs)表达谱分析
　　婴幼儿血管瘤是婴幼儿时期最常见的良性血管性肿瘤，婴幼儿血管瘤的发病率约为3％～10％。临床上婴幼儿血管瘤表现:增生期以出生后一年以内快速增生为特征，消退期以一年以后自发消退为特征，3～5年后可进入消退完成期。增生期婴幼儿血管瘤是以不成熟内皮细胞的异常增殖为特征，而消退期婴幼儿血管瘤的内皮细胞逐渐成熟，血管团块逐渐形成管腔结构，消退完成期婴幼儿血管瘤瘤体的血管结构逐渐由脂肪组织和纤维结缔组织所取代。在增生期婴幼儿血管瘤中，血管瘤内皮细胞成类圆形，细胞核较大，消退期血管瘤中，血管瘤内皮细胞变细长，逐渐成熟。
　　婴幼儿血管瘤由血管瘤干细胞，血管瘤内皮细胞，周细胞，肥大细胞等构成。婴幼儿血管瘤各种细胞组分的成功分离，揭示了血管瘤干细胞的存在。移植血管瘤干细胞于裸鼠体内可以模拟婴幼儿血管瘤的典型三期临床表现，这为研究婴幼儿血管瘤的发病机制提供新的依据，暗示婴幼儿血管瘤可能来源于血管瘤干细胞，婴幼儿血管瘤的增生与消退有可能是与血管瘤干细胞的增殖与消退有关。婴幼儿血管瘤发病机制假说有，胎盘内皮细胞栓塞假说，血管生成或者血管形成能力增加学说，组织缺氧学说。婴幼儿血管瘤中重要的信号通路机制包括，VEGF/VEGFR通路，Notch通路，β肾上腺素受体通路，HIF-α信号通路，PI3K/Akt/mTOR信号通路，PDGFB/PDGFR-β信号通路。
　　虽然关于婴幼儿血管瘤的发病机制存在多种假说，目前婴幼儿血管瘤发病机制不清，血管内皮细胞异常增殖为特征的病理性血管生成是婴幼儿血管瘤的重要病理机制。而血管生成不足通常出现在缺血性疾病如心梗、中风等相关性疾病，而过度血管生成常在肿瘤增殖、炎症反应和视网膜病变等生理过程中起负面作用。故探究婴幼儿血管瘤血管生成的相关机制，亦有利于揭示病理性血管生成相关性疾病的发病机制。
　　长链非编码RNAs(lncRNAs)是一类长度＞200碱基的几乎不编码蛋白的RNA。LncRNAs参与大量生命活动过程，如染色体印记，表观遗传学调控，细胞周期调控，细胞凋亡调控，多能干细胞的调控等。LncRNAs在肿瘤、心血管、神经发育等病理生理活动中起重要调控作用。在血管生成方面，lncRNAs在生理性血管生成及病理性血管生成中起重要调控作用，例如在血管内皮细胞中，抑制lncRNAMALAT1促进细胞迁移同时抑制细胞增殖能力;在糖尿病相关肾脏微循环障碍，敲减LncRNA RNCR3可减轻肾脏血管功能障碍;糖尿病视网膜病变中，敲减lncRNAMIAT明显减轻糖尿病诱发的微循环障碍症状。故lncRNAs有可能在病理性新生血管生成中起到重要调控作用。
　　目前lncRNA在婴幼儿血管瘤方面的表达情况及作用机制尚不清楚，本研究拟在现有工作基础上，对目标长链非编码RNA在婴幼儿血管瘤发病机制之一的病理性血管生成作用方面，进行效应及机制的深入研究，可进一步完善lncRNA在婴幼儿血管瘤发生中的作用机理，也有可能为病理性血管生成相关性疾病的研究提供有力依据。
　　研究目的:本章节拟利用lncRNA芯片技术进行婴幼儿血管瘤组织中lncRNA表达谱分析，通过生物信息学分析差异表达的LncRNA，筛选出与血管生成相关的lncRNA，采用QPCR验证其在婴幼儿血管瘤瘤体中的表达量，并初步探讨其功能，为婴幼儿血管瘤的病理机制的研究提供新的突破点。
　　研究方法:收集2013年6月份到2016年6月份山东省立医院烧伤整形外科就诊的增生期婴幼儿血管瘤及瘤体旁组织的标本，存放于液氮中。采用Trizol一步法提取RNA，应用基因芯片技术进行婴幼儿血管瘤瘤体对比瘤体旁正常组织进行lncRNA及mRNA表达谱分析。芯片数据进行差异表达基因的生物信息学分析，并结合文献，选择目的分子。采用荧光定量PCR检测目标lncRNA表达量，验证目标lncRNA是否差异性表达，并判断差异表达倍率是否与芯片分析结果一致。
　　结果:增生期婴幼血管瘤lncRNA+mRNA表达谱芯片分析数据经过标准化分析处理，选择变化倍率超过2倍，p＜0.05，为差异表达lncRNA和mRNA。相对于增生期婴幼儿血管瘤体旁正常组织，婴幼儿血管瘤瘤体，有1259个lncRNA高表达，857个lncRNA低表达，另外有1469个mRNA高表达，1184个mRNA低表达。这些数据资料已上传GEO数据库(GSE78811)。
　　采用KOBAS2.0系统分析差异表达mRNA，其中排名前30的GO条目包括大血管发育，血管调节，血管发生，细胞迁移，内皮细胞发育，心血管系统发育，血管生成和组织迁移。排名前30的通路信息条目包括“一氧化氮激活鸟苷酸环化酶”，“表皮生长因子受体(EGFR)与磷脂酶C-gamma的相互联系”，“血管内皮生长因子信号通路(VEGF)”，“血管平滑肌收缩”，“神经生长因子信号通路(NGF)”，“非整合膜蛋白-细胞外基质和Rho GTPase环路相互作用”。共表达网络关联分析图展示MEG3，MEG8，FENDRR和Linc00152与之相关mRNA的关系，提示一个lncRNA有可能与几个到数十个mRNAs相关联。
　　根据文献及生物信息学分析，选择目标靶分子进行QPCR分析，其中文献推荐的分子有MALAT1，MEG3，MEG8，FENDRR，Linc00152，根据生物信息学分析选定的分子有p29066，p33867，p44557_v4和p8683，选定的mRNA分子为FOXF1，EGFL7。采用QPCR法在大样本中验证芯片结果;其中9个lncRNAs(MALAT1，MEG3，MEG8,p29066,p33867,FENDRR,linc00152,p44557_v4,and p8683)和2个mRNAs(FOXF1，EGFL7)经过QPCR验证，与芯片结果一致。
　　结论及意义:
　　1.首次进行增生期婴幼儿血管瘤瘤体对比瘤体旁正常组织的lncRNA的表达谱芯片分析，结果为有1259个lncRNA高表达，857个lncRNA低表达，另外有1469个mRNA高表达，1184个mRNA低表达，提示lncRNA和mRNA分子在婴幼儿血管瘤中存在显著差异性表达。
　　2.生物信息学分析显示，排名前30的GO条目包括大血管发育，血管调节，血管发生，细胞迁移，内皮细胞发育，心血管系统发育，血管生成和组织迁移，共表达网络关联图展示MEG3，MEG8，FENDRR和Linc00152与之相关mRNA的关系，提示差异表达的lncRNA可能与婴幼儿血管瘤中血管生成机制存在相关性。
　　3.差异表达的lncRNA中，我们选取文献推荐的分子MALAT1，MEG3，MEG8，FENDRR，linc00152，根据生物信息学分析选定的分子p29066，p33867，p44557_v4和p8683，选定的mRNA分子为FOXF1，EGFL7为目标分子，进行QPCR分析，结果与芯片结果相一致。提示差异表达的lncRNA可能与婴幼儿血管瘤的疾病发展存在相关性。
　　第二部分:MALAT1在婴幼儿血管瘤组织的表达及功能研究
　　研究目的:我们前期工作发现婴幼儿血管瘤瘤体lncRNA存在显著差异表达，其中明星分子MALAT1表达上调明显。在新生血管生成中，lncRNA MIAT及MALAT1在糖尿病视网膜病变中促进新生血管生成。而婴幼儿血管瘤以病理性血管生成为特征。本试验目的在于探究婴幼儿血管瘤中过表达的MALAT1是否对血管生成过程有调控作用。
　　研究方法:首先扩大样本量，采用QPCR法探究MALAT1在婴幼儿血管瘤瘤体中的表达量。再次采用shRNA慢病毒感染脐静脉内皮细胞，采用MTT法探究MALAT1在细胞增殖方面的作用，采用流式细胞仪法检测MALAT1在细胞周期调控方面的作用，检测细胞凋亡情况，采用血管生成实验检测MALAT1对血管生成的调控作用。
　　结果:扩大样本量后，MALAT1在增生期婴幼儿血管瘤中依然存在高表达;shRNA病毒感染法敲减MALAT1，敲减组MALAT1表达量约为对照组的41％，MTT实验提示敲减MALAT1显著抑制细胞增殖，流式细胞仪检测提示敲减MALATI显著引起S期延长，凋亡检测提示敲减MALAT1诱导凋亡，血管生成实验提示敲减MALAT1抑制体外血管生成。
　　结论及意义:MALAT1在增生期婴幼儿血管瘤中存在高表达，敲减MALAT1显著抑制脐静脉内皮细胞增殖，促进细胞凋亡，抑制体外血管生成。故过表达的MALAT1有可能在婴幼儿血管瘤增生期的快速增殖和快速血管生成中起重要作用。
　　第三部分:FENDRR及FOXF1在婴幼儿血管瘤组织中的表达及其机制研究
　　研究目的:前期工作发现血管瘤瘤体lncRNA存在显著差异表达，其中FENDRR及其邻近转录因子FOXF1表达上调明显，FENDRR为表达上调倍率最高的lncRNA分子。FENDRR在胚胎时期的大血管心脏及体壁的发育中起重要调节作用，在血管内皮细胞的研究中发现FOXF1促进体外血管生成，同时FOXF1促进胚胎时期大血管发育。婴幼儿血管瘤以血管生成活动过度为特征，而FENDRR和FOXF1在婴幼儿血管瘤中虽表达增高，但其作用及机制尚不清楚。故该课题旨在探究FENDRR在婴幼儿血管瘤中的作用，及FOXF1与FENDRR之间的调控机制研究。
　　研究方法:本课题拟扩大样本量采用QPCR法验证FENDRR与FOXF1表达量;采用shRNA构建慢病毒转染细胞后构建FENDRR敲减细胞株，采用MTT法、流式细胞仪检测法、血管生成实验探究FENDRR的细胞学功能;采用荧光素酶报告基因法探究FOXF1是否调控FENDRR的表达;于HUVEC中转染慢病毒敲减FENDRR，后采用QPCR法检测FOXF1表达量;于HUVEC中转染过表达FOXF1慢病毒，后采用QPCR法检测FENDRR表达量;采用表达谱芯片法探究FENDRR调控血管生成间接机制，选择目标蛋白，采用蛋白质印迹法验证芯片结果。
　　结果:
　　1.QPCR实验证实，lncRNA FENDRR及转录因子FOXF1在增生期婴幼儿血管瘤组织中的相对于瘤体旁正常组织存在显著高表达，且FENDRR的表达量与FOXF1的表达量之间存在正相关。
　　2.体外功能学实验发现，于脐静脉内皮细胞中敲减FENDRR后，可显著抑制脐静脉内皮细胞增殖，诱导细胞凋亡，细胞周期检测发现敲减FENDRR可引起G2/M期阻滞，体外血管生成实验发现，敲减FENDRR可显著抑制血管生成现象。
　　3.为探究转录因子FOXF1是否可以转录激活LncRNA FENDRR，采用荧光素酶报告基因实验，证实FOXF1可转录激活FENDRR;另外，在脐静脉内皮细胞中过表达FOXFI，FENDRR的表达量显著升高;在脐静脉内皮细胞中敲减FENDRR后，QPCR法检测FOXF1表达量显著下降。提示转录因子FOXF1与FENDRR之间可能存在负反馈调节机制。
　　4.为探究lncRNA FENDRR的下游调节机制，采用基因表达谱芯片分析，结果为在脐静脉内皮细胞中敲减FENDRR后，相对于对照组，敲减FENDRR组上调基因364，下调基因207个（表达量变化大于1.5倍，且P值要小于0.05），IPA分析提示，EIF2信号通路被显著抑制，AMPK信号通路被显著激活，鉴于功能学实验提示敲减FENDRR抑制细胞增殖和血管生成，并可引起细胞周期的G2/M期阻滞，我们选取相关调节基因，如PLK1，KIAA0101和CCND2，采用Western Blot法验证其表达量，提示敲减FENDRR可抑制PLK1，KIAA0101和CCND2表达量。
　　结论及意义:
　　1.增生期婴幼儿血管瘤中，转录因子FOXF1及lncRNA FENDRR显著高表达，且FENDRR与FOXF1的表达量存在正相关。
　　2.FOXF1激活的过表达FENDRR，有可能通过激活PLK1，KIAA0101和CCND2表达，起到促进细胞增殖，促进血管生成的效果。
　　3.探究FENDRR与新生血管生成相关机制有可能揭开LncRNA在婴幼儿血管瘤发病中的作用，为新生血管生成性疾病的靶向治疗提供靶点。
　　第四部分结论及创新点
　　结论
　　1.婴幼儿血管瘤lncRNA表达谱分析发现约1259个lncRNA分子上调，857个lncRNA分子下调，另外有1469个mRNA高表达，1184个mRNA低表达。其中经验证9个lncRNA和2个mRNA经过QPCR验证表达存在明显差异，且差异变化规律与芯片结果一致。
　　2.LncRNA MALAT1在增生期婴幼儿血管瘤中显著高表达。功能学实验中，敲减MALAT1可显著抑制细胞增殖，抑制血管生成，诱导S期阻滞。
　　3.LncRNA FENDRR在增生期婴幼儿血管瘤中高表达。功能学实验中，下调FENDRR可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，诱导G2/M期阻滞，同时抑制血管生成。
　　4.机制研究发现FOXF1可转录激活FENDRR，抑制FENDRR可通过下调PLK1，KIAA0101和CCND2的表达来产生抑制血管生成、抑制增殖、诱导凋亡、引起G2/M阻滞的效应。
　　创新性:
　　1.首次在婴幼儿血管瘤中采用表达谱芯片法研究长链非编码RNA的差异表达，并应用生物信息学分析结合文献选定目标分子，为深入研究lncRNA在婴幼儿血管瘤的功能及其机制提供依据。LncRNAs在病理性血管生成及生理性血管生成中均起到重要的调控作用，而婴幼儿血管瘤的病理特征为病理性血管生成，故从婴幼儿血管瘤组织中筛选出差异表达的lncRNA分子，并探究其在病理性血管生方面的作用及其机制，有可能为其他病理性血管生成性疾病的研究提供有力依据。
　　2.首次发现MALAT1在增生期婴幼儿血管瘤中高表达，MALAT1促进内皮细胞增殖，促进血管生成。提示MALAT1具有促进细胞增殖和血管生成的作用，MALAT1在婴幼儿血管瘤中有可能起到促进血管瘤内皮细胞增殖和血管生成的作用，MALAT1有可能成为治疗血管过度生成性疾病的新靶点，这为血管生成性疾病的机制研究及治疗提供依据。
　　3.首次发现转录因子FOXF1诱导的过表达FENDRR通过PLK1，KIAA0101，CCND2促进内皮细胞增殖，促进血管生成。提示FENDRR具有促进细胞增殖和促进血管生成的作用，FENDRR有可能参与婴幼儿血管瘤的发病机制，并且FENDRR有可能成为治疗血管生成相关性疾病的新靶点。本研究深入探讨并明确目标lncRNA FENDRR及通路中相关分子对血管瘤的调控作用，不但可以完善血管瘤的发病机制，填补相关领域的空白，而且可以从分子生物学角度为婴幼儿血管瘤的疾病干预提供理论依据。进而为其它相关疾病如肿瘤、糖尿病等领域的血管生成干预提供重要参考。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分：基于转录组芯片的婴幼儿血管瘤组织中长链非编码RNAs(lncRNAs)表达谱分析

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分：MALATl在婴幼儿血管瘤组织的表达及功能研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第三部分：FENDRR及FOXF1在婴幼儿血管瘤组织中的表达及其机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

总结

附表图

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的论文

学位论文评阅及答辩情况表

外文论文1

外文论文2