微型近红外光谱仪用于氨基葡萄糖关键生产过程中的质量分析研究

摘要

氨基葡萄糖(glucosamine，GlcN)是一种广受欢迎的骨关节保健品，市场前景广阔，目前主要生产方式包括甲壳类动物外壳水解法、甲壳素酶解法和微生物发酵法。由于受到原材料供应、价格、环保等诸多方面制约，微生物发酵法将逐渐取代其它两种方法成为GlcN的主要生产法。微生物发酵法生产GlcN虽然具有诸多方面的优势，但复杂度高、参数众多的非线性动态生产过程带来了较高的分析检测成本，这使得企业的利润被大大压缩，并且传统的分析检测技术耗时较长，无法将检测结果及时反馈给生产部门，影响产品的质量特别是产品品质的批间一致性。因此，将先进的过程分析技术(Process Analytical Technological，PAT)引入到GlcN的生产过程中，借助快速、准确、绿色、检测成本低的PAT工具一近红外光谱分析技术(Near Infrared Spectroscopy，NIRS)，对实现GlcN关键生产过程中的质量指标快速检测从而降低生产成本、提高产品质量有重要的研究意义。目前，NIRS经过半个多世纪的发展，已经成为一个比较成熟、应用广泛的PAT工具，并且随着科技的发展，近红外光谱仪的种类已十分繁多，微型化、便携化、低成本化成为仪器研发的潮流与趋势，在制药过程中也有着越来越多的应用。
　　由于采用发酵法生产GlcN时，直接得到GlcN产物时收率低，所以采用先发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc)，然后脱乙酰得到目标产品GlcN。因此，本研究首先对NIRS用于GlcNAc浓度测定的可行性进行分析，然后将NIRS引入到关键生产过程一发酵过程和浓缩过程，探究NIRS在发酵法生产GlcN过程中应用的可行性。
　　本文具体内容如下:
　　(1)微型近红外光谱仪用于发酵过程中GlcNAc浓度测定的可行性研究
　　本研究分析了傅里叶变换近红外光谱仪和微型近红外光谱仪测定不同体系下GlcNAc浓度的可行性，对两种仪器的测定结果进行了对比分析，为下一步生产过程引入微型近红外光谱仪奠定基础。首先，以纯水-GlcNAc体系为研究对象，实验室条件下配制得到浓度为4.00-160.00 g/L的GlcNAc水溶液样品40个，分别以FT-NIR光谱仪和Micro-NIR1700型微型近红外光谱仪采集光谱;然后，采用含量梯度法将40个样品划分得到校正集27个、验证集13个样品，经过预处理后建立用于GlcNAc浓度测定的偏最小二乘回归(Partial Least Square Regression，PLSR)定量分析模型;最后，以Passing-Bablok回归法对两种近红外光谱仪测定纯水体系下GlcNAc浓度的准确性进行对比分析，结果表明Micro-NIR1700型微型近红外光谱仪与FT-NIR光谱仪间的预测结果没有显著性差异。随后，采用同样的研究方法对NIRS，特别是微型近红外光谱仪用于发酵液复杂体系下GlcNAc浓度测定的可行性进行了分析，结果显示NIRS可实现发酵液复杂体系下GlcNAc浓度的测定，并且Micro-NIR1700型微型近红外光谱仪与FT-NIR光谱仪间的预测结果没有显著性差异。
　　(2)微型近红外光谱仪用于发酵过程中GlcNAc浓度和光密度(Optical Density，OD)值的测定研究
　　本研究将Micro-NIR1700型微型近红外光谱仪引入发酵过程中，探究NIRS测定发酵液中GlcNAc浓度和OD值的可行性。首先在正常生产条件下采集135个样品，以高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)测定GlcNAc浓度，分光光度法测定OD值;然后以90个样品为校正集，45个样品为验证集，分别建立起GlcNAc浓度和OD值的PLSR定量模型，并通过比较不同的数据集划分方法、光谱预处理方法及变量选择方法对模型进行优化，最终得到的GlcNAc浓度和OD值定量模型的R2c、R2p、RMSECV和RMSEP值分别为0.994、0.995、2.7927 g/L和1.9468 g/L及0.957、0.947、7.8032和7.1084。研究结果表明建立的模型拥有良好的预测能力，可以实现发酵过程中GlcNAc浓度和OD值的快速、同时测定。
　　(3)微型近红外光谱仪用于浓缩过程中GlcNAc含量的测定研究
　　本研究将Micro-NIR1700型微型近红外光谱仪用于氨基葡萄糖浓缩过程中GlcNAc含量的测定，以实现浓缩过程中GlcNAc含量的快速测定及浓缩终点的判断。首先在实验室条件下平行模拟两批浓缩过程，从过程中取样37个，然后从正常生产过程中取样13个，总共采集样品50个。接着以50个样品建立起GlcNAc含量的定量分析模型，在建模过程中，分别对数据集划分方法、光谱预处理方及变量选择方法进行详细探讨以进一步优化模型，最终以38个变量建立GlcNAc含量定量模型，模型的R2c、R2p、RMSECV和RMSEP值分别为0.992、0.991、1.3436％和0.9496％。研究结果表明建立的模型拥有良好的预测能力，可以实现浓缩过程中GlcNAc含量的快速测定及浓缩终点的判断。
　　本论文的创新点包括:
　　(1)本论文首次对比了FT-NIR光谱仪和Micro-NIR1700型微型近红外光谱仪在不同体系下GlcNAc浓度测定的准确性。
　　(2)首次将微型近红外光谱仪引入到发酵法生产GlcN的发酵过程，同时实现了发酵过程中GlcNAc浓度和OD值的快速、准确检测。
　　(3)首次将微型近红外光谱仪引入到发酵法生产GlcN的浓缩过程，实现了浓缩过程中GlcNAc含量的快速检测和终点判断。

目录

声明

摘要

符号说明

1 氨基葡萄糖

1．1 氨基葡萄糖概述

1．2 氨基葡萄糖的生产方式

1．3 氨基葡萄糖的用途

2 过程分析技术

2．1 过程分析技术的提出

2．2 过程分析技术的优势

2．3 过程分析技术在制药领域的应用

3 近红外光谱分析技术

3．1 近红外光谱分析技术的提出

3．2 近红外光谱分析技术的优缺点

3．3 近红外光谱仪器的发展与分类

3．4 近红外光谱分析技术的分析流程

3．5 近红外光谱分析技术在糖类药物中的应用

4 本课题的研究目的及意义

5 本课题主要研究内容

第二章 NIRS用于发酵过程中GlcNAc浓度测定的可行性研究

1．1 材料

1．2 方法

1．3 实验结果

2 发酵液-GlcNAc体系

2．1 材料

2．2 方法

2．3 实验结果

3 讨论和结论

第三章 NIRS用于微生物发酵法生产GlcN发酵过程的监测研究

1 材料

1．1 仪器

1．2 软件

2 方法

2．1 样品的采集

2．2 样品光谱的采集

2．3 模型的建立

3 实验结果

3．1 样品的原始光谱

3．2 样品中GlcNAc浓度和OD值测定结果

3．3 数据集划分

3．4 光谱数据预处理

3．5 变量选择

3．6 最佳模型建立

4 讨论和结论

第四章 NIRS用于微生物发酵法生产GlcN浓缩过程的监测研究

1．材料

1．1 试剂

1．2 仪器和软件

2．方法

2．1 样品的采集

2．2 样品光谱的采集

2．3 样品中GlcNAc含量测定

2．4 定量分析模型的建立

3．实验结果

3．1 样品的原始光谱

3．2 样品的GlcNAc含量测定结果

3．3 数据集划分

3．4 光谱预处理

3．5 建模变量选择结果

3．6 模型优化和最优模型的确定

3．7 模型的评价

4 讨论与结论

1 总结

2 展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文