核黄素联合360nmUVA或440nm蓝光角膜胶原交联治疗兔真菌性角膜炎的实验研究

摘要

本文主要从以下几部分进行论述：
　　第一部分 兔真菌性角膜炎动物模型制作
　　目的：建立兔浅层真菌性角膜炎动物模型,探讨模型制作过程中的注意事项,观察感染前后角膜及其他眼部变化,并通过角膜刮片培养及共聚焦显微镜检查明确真菌感染及感染菌种。
　　方法：健康成年新西兰大白兔48只,体重2.5～3.0kg,雌雄均用,排除眼前段活动性疾病,预饲养两周。实验兔随机分为三组,分别为:360组,440组和空白对照组。48只实验兔均采用右眼为模型眼,A型超声角膜测厚仪测定兔眼角膜中央厚度。用10％水合氯醛腹腔注射麻醉(3ml/kg),右眼用盐酸奥布卡因滴眼液(倍诺喜)表面麻醉3次,固定头部;在眼科手术显微镜下,开睑器开睑后,生理盐水冲洗结膜囊,并将提前制备好的浓度为106CFU/ml(Colony-Forming Units,CFU,单位体积中的活菌个数)标准白色念珠菌菌液0.1ml注入角膜中央部浅层基质内,形成直径4mm圆形灰白色区域。制作兔角膜白色念珠菌感染的模型后,通过裂隙灯检查、角膜溃疡刮片培养鉴定菌种、共聚焦显微镜观察真菌。
　　结果：A型超声角膜测厚仪测定兔眼角膜中央厚度,各组间角膜中央厚度无显著性差异。裂隙灯检查角膜真菌感染:白色念珠菌感染后1天,角膜溃疡形成,角膜轻度水肿,能透见虹膜文理,前房无积浓;感染后3天,角膜溃疡灶面积增大,周边可见卫星灶,角膜水肿弥漫性加重,不能透见虹膜;感染后5天,溃疡灶面积进一步扩大,溃疡灶和卫星灶融合,并有苔垢样坏死组织附着,溃疡边缘稍隆起毛糙不齐,角膜弥漫性雾状水肿加重,前房可见积脓。角膜刮片培养:菌落为圆形,较大,表面中间粗糙起皱,假菌丝浸入培养基内,为类酵母菌型菌落典型表现。革兰染色阳性,着色不均匀,可见菌细胞呈圆形或卵圆形,并可见假菌丝。无染色高倍镜可见真菌细胞出芽生成假菌丝,假菌丝不分枝,长短不一;使用YST卡进行菌株鉴定菌种鉴定为白色念珠菌。共聚焦显微镜检查:模型制作后第3～5天,角膜溃疡形成,多次共聚焦显微镜检查,所有模型兔均查见菌丝或孢子,共聚焦显微镜检查可见大量真菌菌丝和炎细胞,菌丝细长弯曲成团索样,高折光。
　　结论：1.兔眼与人眼形态及解剖相近,眼球较大,是感染性角膜炎理想的动物选择。2.在本实验动物模型制作中采用角膜浅基质层注射真菌的方法,成功制作了兔角膜白色念珠菌性角膜炎动物模型,其操作简单、成功率高、角膜刮片容易,并且明显减少了角膜穿孔的风险。
　　第二部分 360nmUVA或440nm蓝光联合核黄素角膜胶原交联对兔真菌性角膜炎的疗效观察
　　背景：真菌性角膜炎是一种致盲率高的严重角膜感染性疾病,近40年来发病率明显增加。目前主要的治疗方式仍然是抗真菌药物局部或联合全身应用,由于大多数抗真菌药物眼组织穿透力小且毒性较大,药物治疗相对棘手。另外角膜溃疡刮除联合碘烧灼也有应用,但效果有限。胶原的高机械强度与胶原结构有密切的关系。角膜胶原交联疗法的基本原理是根据光敏剂核黄素的独特的吸收光谱,在紫外线或可见光的照射下,吸收光子能量,诱导胶原纤维和内部化学基团之间,形成更多的共价键交联,从而增加了胶原生物力学特性,提高了胶原纤维的机械强度和抵抗角膜扩张的能力,增加胶原对酶降解的抵抗力。紫外线A(Ultraviolet Radiation A,UVA)设备使用发光二极管产生的紫外线A波长在360～380nm,此设备包含聚焦系统、焦点距离、光线直径和束均匀度等参数,操作者能根据情况调节参数的大小。角膜胶原交联在眼科应用广泛,特别是对于圆锥角膜和角膜扩张等疗效肯定。核黄素是一种具有3个环状结构的极性分子,具有吸附核酸的特点,能够插入DNA或者RNA碱基内。0.1％核黄素能产生最大的吸收作用,90％紫外线辐射能在角膜基质中被吸收,最大限度保护了角膜内皮,晶状体和视网膜。核黄素在角膜胶原交联过程中具有双重作用,它不但是诱导交联的光敏剂;作为选择性滤波器,核黄素还能够保护下面的组织免受UVA的损伤。另外,足量的核黄素使体内酸性物质减少,不利于真菌生长,因此患者抵御真菌感染的能力增强。360nmUVA联合核黄素角膜交联治疗(corneal cross-lingking,CXL)对真菌性角膜炎的疗效,在动物实验及临床上都得到了证实。我们知道核黄素的吸收波峰包括360nm和440nm,目前核黄素联合360nm UVACXL治疗对真菌性角膜炎的治疗作用已经得到确认,但是核黄素联合440nm蓝光CXL治疗对真菌性角膜炎的疗效尚无人观察。
　　目的：本实验采用兔真菌性角膜炎为动物模型实验的方法,观察分析360nmUVA或440nm蓝光联合核黄素CXL治疗对兔真菌性角膜炎的疗效。
　　方法：兔真菌性角膜炎动物模型48只,已随机分为空白对照组,360组,440组。空白对照组不做任何处理,360组和440组分别行角膜CXL治疗。实验兔用10％水合氯醛腹腔注射麻醉(3ml/kg),右眼用盐酸奥布卡因滴眼液(倍诺喜)表面麻醉3次,固定头部,开睑器开睑,用圆钝刀片刮除直径9.0mm的中央角膜上皮层和表层溃疡组织。0.1％核黄素溶液冲洗角膜,2分钟1次,连续半小时;裂隙灯可观察到前房黄染,确定核黄素充分渗透角膜进入前房。360组采用0.1％核黄素点眼30分钟后,360nmUVA照射30分钟;440组采用0.1％核黄素点眼30分钟后,440nm蓝光照射30分钟;总能量设定均为3mW/cm2,照射距离均为5cm。治疗后1、3、7、15天分别对各组兔进行裂隙灯观察、角膜照相并行溃疡面积计算分析、共聚焦显微镜检查比较。CXL治疗后1、7,15天天各组分别耳缘动脉注气处死4只实验兔,立即剪取其角膜并甲醛固定,切片染色后进行病理观察分析。
　　结果：治疗前各组间溃疡面积比较无统计学意义,治疗后1天各组间比较无统计学意义(P＞0.05);治疗后3天,空白对照组较治疗前增大6.94％,360组角膜溃疡面积减小35.65％,P=0.012;440组角膜溃疡面积减小37.94,P=0.015,数据分析均有显著性差异;360组和440组间比较P=0.88,数据分析没有显著性差异。360组和440组分别与空白对照组比较p＜0.05,数据分析具有显著性差异。治疗后7天,空白对照组较治疗前减小13.14％,360组角膜溃疡面积减小73.82％,P=0.00;440组角膜溃疡面积减小70.00％,P=0.000,数据分析均有显著性差异;360组和440组间比较P=0.75,数据分析没有显著性差异,360组和440组分别与空白对照组比较p＜0.01,数据分析具有显著性差异。治疗后15天,空白对照组溃疡面积减小83.16％;360组核和440组角膜溃疡消失。共聚焦显微镜检查:治疗后1天各组间无明显差异;治疗后3,7天360组和440组较空白对照组真菌菌丝减少,真菌菌丝变短棒样,继而消失,角膜中的炎症细胞较空白对照组减少。治疗后15天,空白对照组可见角膜基质细胞增大增多,炎症细胞和少量真菌菌丝呈短棒状高反光;360组和440组未见菌丝及孢子,可见增大的基质细胞。病理检查结果:CXL治疗后1天:各组均可见角膜炎症反应重,局部角膜上皮缺失,可见溃疡形成,局部可见脓肿灶,周围较多淋巴细胞、中性粒细胞浸润及嗜酸性粒细胞。治疗后7天:空白对照组:角膜坏死严重,溃疡形成,局部角膜穿孔,炎症反应重;360组角膜炎症反应相对较轻,角膜水肿,散在淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及少量中性粒细胞浸润,纤维细胞母细胞及小血管增生,未见明显坏死及溃疡形成;440组角膜炎症反应相对较轻,角膜水肿,散在淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及少量中性粒细胞浸润,纤维细胞母细胞及小血管增生,未见明显坏死及溃疡形成。治疗后15天:空白对照组角膜溃疡不明显,局部角膜上皮缺失,角膜轻水肿,散在淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及少量中性粒细胞浸润,纤维细胞母细胞及小血管增生。360和440组未见角膜溃疡,角膜上皮完整,可见纤维母细胞增生。
　　结论：360nmUVA和440nm蓝光联合核黄素CXL对兔真菌性角膜炎的治疗均有效,治疗效果无明显差异。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 研究背景

1．1 角膜组织结构和功能

1．2 角膜胶原交联概述

1．2．1 角膜胶原交联的原理

1．2．2 核黄素的特性及应用

1．2．3．光波特性

1．2．4 CXL临床应用

1．2．5 小结

1．3．真菌性角膜炎概述

1．3．1 真菌性角膜炎的诊断

1．3．2 真菌性角膜炎的治疗

1．3．3 真菌性角膜炎预后

第二章：兔真菌性角膜炎动物模型制作

2．1．前言

2．1．1 实验兔纳入标准

2．1．2 真菌菌液浓度选择

2．2．材料和方法

2．2．1．主要试剂和仪器

2．2．2．实验方法

2．2．3．观察方法

2．3．结果

2．3．1 兔中央角膜厚度测量结果

2．3．2 裂隙灯观察结果

2．3．3 角膜刮片培养结果

2．3．4 共聚焦显微镜观察结果

2．4．2 动物模型制作成功的标准

2．5 结论

第三章 360nm和440nm联合核黄素角膜胶原交联对兔真菌性角膜炎的疗效观察

3．1 前言

3．2 材料和方法

3．2．1 主要试剂和仪器

3．2．2 实验方法

3．2．3 观察指标

3．3 结果

3．3．1 A型超声角膜测厚仪测定兔眼角膜中央厚度(nm，均数±标准差)

3．3．2 裂隙灯观察结果

3．3．3 角膜溃疡面积计算

3．3．4．共聚焦显微镜检查结果

3．3．5 病理检查结果

3．4 讨论

3．5．结论

第四章 总结和展望

4．1 总结

4．2 主要创新点

4．3 展望

附图

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表和待发表的论文

角膜胶原交联在眼科的应用

英文论文