冰岛硫化叶菌ESCRT-Ⅲ同源蛋白在细胞分裂和病毒出芽过程中的功能研究

摘要

细胞分裂是所有细胞生命体的重要生命过程。在细菌中，细胞分裂过程主要由FtsZ和FtsA(MreB)介导，其中FtsZ和FtsA分别是真核生物微管蛋白和肌动蛋白的同源蛋白;FtsA可以帮助FtsZ在即将发生分裂的细胞中间位置形成收缩环，随后有超过20种蛋白在收缩环处组装形成分裂体，同时收缩环提供收缩力，最终将两个姊妹细胞分离开来。
　　在真核生物中，细胞分裂的起始是由肌动蛋白和肌球蛋白在即将发生分裂的细胞分裂沟处形成收缩环，收缩环的收缩将细胞分成了两大部分，此时的姊妹细胞仍由细胞间桥和中间体连接;最后ESCRT-Ⅲ蛋白复合物被招募到中间体处，并对中间体一端的细胞膜进行切割，最终两个姊妹细胞完成分离。
　　在古菌中，截至目前的研究证明至少存在三种细胞分裂方式:在广古菌(Euryarchaeota)和纳古菌(Nanoarchaeota)中，利用基于FtsZ的类似细菌的细胞分裂方式;在包含绝大多数泉古菌在内的TACK[奇古菌(Thaumarchaeota)、曙古菌(Aigarchaeota)、泉古菌(Crenarchaeota)和古古菌(Korarchaeota)]和Asgard[洛基古菌(Lokiarchaeota)、托尔古菌(Thorarchaeota)、奥丁古菌(Odinarchaeota)和海姆达尔古菌(Heimdallarchaeota)]中，利用类似真核生物的ESCRT-Ⅲ分裂机器的细胞分裂方式;在泉古菌的热变形菌目（Thermoproteales）中，利用基于古菌肌动蛋白(Crenactin)的细胞分裂方式。
　　硫化叶菌细胞利用类似真核生物的ESCRT-Ⅲ分裂机器进行细胞分裂，它包含三个蛋白CdvA、ESCRT-Ⅲ(CdvB)和Vps4(CdvC);其中CdvA是古菌特有的一个蛋白，ESCRT-Ⅲ和Vps4分别是真核生物ESCRT-Ⅲ和Vps4的同源蛋白。与真核生物类似，硫化叶菌细胞中也含有多个ESCRT-Ⅲ蛋白。除了ESCRT-Ⅲ，硫化叶菌细胞同时编码另外三个ESCRT-Ⅲ的同源蛋白，分别命名为ESCRT-Ⅲ-1(CdvB1)、ESCRT-Ⅲ-2(CdvB2)和ESCRT-Ⅲ-3(CdvB3)。这三个ESCRT-Ⅲ同源蛋白是否参与到细胞分裂过程，以及包括CdvA、ESCRT-Ⅲ在内的参与细胞分裂的蛋白它们具体在细胞分裂过程的哪一阶段发挥作用都还不清楚。本文在冰岛硫化叶菌（Sulfolobusislandicus）细胞中，利用遗传学和细胞学等方法，分析鉴定了这些ESCRT-Ⅲ同源蛋白的功能，并对这些参细胞分裂过程的蛋白进行了功能定位。
　　发现ESCRT-Ⅲ-1和ESCRT-Ⅲ-2能够定位在即将发生分裂的细胞中间形成带状（环状）结构，并且随着细胞分裂过程的进行，这些带状结构会逐渐发生收缩，说明ESCRT-Ⅲ-1和ESCRT-Ⅲ-2直接参与到细胞分裂过程，而ESCRT-Ⅲ-3在细胞中呈相对均一、弥散的分布，说明ESCRT-Ⅲ-3在细胞分裂过程不发挥作用;与它们发挥的功能相对应，escrt-Ⅲ-1和escrt-Ⅲ-2对冰岛硫化叶菌细胞是必需的，而escrt-Ⅲ-3是非必需的，敲除escrt-Ⅲ-3对细胞的生长和形态没有显著影响。
　　分析了冰岛硫化叶菌细胞中这些参与细胞分裂过程蛋白的相互作用网络，基于这个蛋白相互作用网络和对这些蛋白二级结构的分析，构建了它们的C-端缺失突变体，以阻断这些蛋白间的相互作用。通过在冰岛硫化叶菌细胞中过表达这些突变体，证明这些蛋白分别在细胞分裂过程的不同阶段发挥重要的作用，这些结果对于阐明硫化叶菌细胞分裂的具体过程具有重要的意义。另外引人关注的是，在过表达ESCRT-Ⅲ-2蛋白C-端缺失突变体的细胞中观察到了类似真核生物细胞分裂后期的细胞间桥和中间体的结构，这是迄今为止在古菌细胞中第一次观察到这样的结构，这些结果进一步说明了硫化叶菌细胞可能采用了类似真核生物的细胞分裂机制，同时也增加了古菌和真核生物细胞所具有的新的共同特点。
　　在真核生物中，ESCRT-Ⅲ蛋白除了在细胞分裂过程发挥重要作用，它们还在其它很多过程发挥功能，例如膜包被病毒的出芽过程。Sulfolobus tengchongensis spindle virus2(STSV2)是从中国云南腾冲热泉中分离的一种膜包被的单尾梭状病毒，它可以在硫化叶菌细胞中长时间的培养，并且在不同的压力条件下尚未发现STSV2能够裂解宿主细胞，因此它是古菌中研究病毒与宿主关系的一个理想的模式病毒。在本文的研究工作中，在感染STSV2的冰岛硫化叶菌野生型菌株REY15A中观察到了出芽的现象，同时发现ESCRT-Ⅲ-3能够定位在出芽位置;而在感染STSV2的△escrt-Ⅲ-3菌株中则观察不到出芽现象，这说明ESCRT-Ⅲ-3在由感染STSV2引起的出芽过程中发挥重要功能。另外，发现ESCRT-Ⅲ-1和ESCRT-Ⅲ-2也能够定位在出芽位置，说明ESCRT-Ⅲ-1和ESCRT-Ⅲ-2也可能参与到出芽过程。真核生物HIV-1、流感病毒以及埃博拉病毒等膜包被病毒一般也都采用出芽的方式从宿主细胞表面释放，ESCRT-Ⅲ蛋白在这些病毒的出芽释放过程中起到了重要的作用。我们的研究结果说明STSV2采用了类似真核生物膜包被病毒的出芽过程从宿主细胞表面释放的机制，在这个过程中ESCRT-Ⅲ蛋白发挥了重要的作用。
　　现在越来越多的比较基因组学及系统进化分析数据支持真核生物的古菌起源学说，但其中最大的不足是它们缺少实验证据的支持。我们的研究结果从实验层面上支持了真核生物古菌起源的进化学说，在进化上具有重要的意义;同时也可为研究真核生物细胞分裂和膜包被病毒的出芽过程提供一定的参考，也有可能为将来在辅助治疗人类HIV-1、流感病毒以及埃博拉病毒方面提供一定的帮助。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．古菌概述

1．1 古菌的系统分类

1．2 古菌的特征

1．3 硫化叶菌

2．细胞分裂过程概述

2．1 细菌、真核生物和古菌细胞分裂机制概述

2．2 ESCRTs蛋白功能介绍

2．3 硫化叶菌ESCRT-Ⅲ蛋白的研究进展

3．病毒释放机制概述

3．1 古菌病毒概述

3．2 古菌病毒的释放机制

3．3 真核生物膜包被病毒的组装和释放

4．硫化叶菌遗传操作系统

4．1 冰岛硫化叶菌受体菌株

4．2 冰岛硫化叶菌基因敲除系统

4．3 冰岛硫化叶菌蛋白表达系统

5．研究目的和意义

第二章 材料与方法

1．材料

1．1 酶和试剂

1．2 寡核苷酸序列

1．3 质粒

1．4 菌株

1．5 培养基配方

2．实验方法

2．3 质粒提取(Plasmid Mini Kit-OMEGA)

2．4 冰岛硫化叶菌蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化。

2．5 Western blot方法与步骤

2．6 免疫荧光样品制备

2．7 冰岛硫化叶菌感受态细胞制备与电转化

2．8 冰岛硫化叶菌菌株保存

2．9 流式细胞术样品制备

2．10 Southern Blot方法与步骤

2．11 酵母双杂交方法与步骤(Clontech)

2．12 扫描电镜样品制备与观察

第三章 冰岛硫化叶菌ESCRT-Ⅲ同源蛋白免疫荧光定位

1．引言

2．结果

2．2 冰岛硫化叶菌ESCRT-Ⅲ同源蛋白抗体特异性检测

2．3 冰岛硫化叶菌ESCRT-Ⅲ同源蛋白免疫荧光定位

3．小结

第四章 冰岛硫化叶菌ESCRT-Ⅲ同源蛋白遗传必需性分析

1．引言

2．结果

2．1 escrt-Ⅲ-2(SiRe_1200)遗传必需性分析

2．2 escrt-Ⅲ-1(SiRe_1550)遗传必需性分析

2．3 escrt-Ⅲ-3(SiRe_1388)遗传必需性分析

3．小结

1．引言

2．结果

2．1 生物信息学对硫化叶菌中ESCRT-Ⅲ蛋白MIM2结构域的分析

2．2 冰岛硫化叶菌参与细胞分裂和膜剪切过程蛋白二级结构预测

2．3 冰岛硫化叶菌参与细胞分裂和膜剪切过程蛋白相互作用的验证

2．4 冰岛硫化叶菌细胞分裂蛋白的功能定位

2．5 Sis／pSeSD-ESCRT-Ⅲ-2△C菌株显微观察和免疫荧光定位

3．小结

第六章 ESCRT-Ⅲ同源蛋白参与病毒出芽过程的研究

1．引言

2．结果

2．1 escrt-Ⅲ-3敲除型突变体菌株感染STSV2后表型分析

2．2 STSV2感染S．islandicus REY15A不同时期免疫荧光定位分析

2．3 ESCRT-Ⅲ-3蛋白性质和功能分析

2．4 ESCRT-Ⅲ同源蛋白与STSV2衣壳蛋白相互作用的研究

3．小结

总结

展望

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢