21-羟化酶缺陷症患者基因型-表型分析及四个CYP21A2基因新突变的功能学研究

摘要

本文主要从以下几方面进行论述：
　　第一部分 患者临床资料的收集及突变分析
　　目的：
　　分析72例山东省21-OHD患者的临床特征及性激素水平，分析患者人群的热点突变频率，同时进行新突变的同源性分析。
　　方法：
　　1.收集了2012-2017年于山东省立医院就诊的72例21-OHD患者的临床资料，包括病历资料、实验室检查等，并对其进行详尽分析。
　　2.留取患者外周全血，提取DNA后利用PCR技术对CYP21A2基因进行扩增，再利用MLPA技术结合Sanger测序对其进行检测并与正常参考序列进行比对，寻找致病突变。
　　3.统计检测到的各个突变的详细信息，分析患者人群的热点突变频率。
　　4.对本次研究发现的4个未被报道的新发CYP21A2基因突变进行同源性分析。
　　结果：
　　1.72名患者中男性患者37人，女性患者35人，平均确诊年龄为3.5±7.6岁。其中有47人(65.3％)诊断为SW型，11人(15.3％)为SV型，14人(19.4％)为NC型。
　　2.62.5％的患者皮肤呈现色素沉着，为最常见的临床症状。其他较为常见的临床症状有阴蒂肥大(37.5％)及外周性性早熟-阴茎提前发育(13.9％)。在56名婴幼儿患者中，最常见的症状为吐奶(42.9％)及体重不增长(12.5％)。
　　3.共检测到25种突变类型，最常见的突变为I2G(32.6％)，Large lesion(20.6％)，I173N(17％)和Q319X(7.1％)，其中还包含4个未被报导过的新突变:p.L199X，p.E321del，p.H393Q和p.L459_P464del，新突变的检出率为2.8％(4/141)。
　　4.在Uniprot网站上获取多种哺乳动物（猪，牛，狗，猫及大鼠、小鼠）的CYP21蛋白序列，利用Pubmed网站的BLAST功能比对其与人的CYP21蛋白序列在321位、393位及459-464位氨基酸残基位点及其邻近位点的区别，发现氨基酸残基E321、H393、L459 P464均位于CYP21蛋白的高度保守区域，而p.L199X造成CYP21蛋白截短。
　　结论：
　　1.在72名中国21-OHD患者中，SW为最常见的临床分型，就诊的患者中最常见的症状为皮肤色素沉着，其中婴幼儿患者中最常见的症状为吐奶。
　　2.72个患者中共检测到141个突变的等位基因，检出率为97.9％(141/144)。最常见的突变为I2G(32.6％)，与之前欧美国家相关研究报道的突变分布情况相似。
　　3.推测四种新发突变p.L199X，p.E321del，p.H393Q和p.L459_P464del均可能对CYP21蛋白的功能造成较为严重的影响。
　　第二部分 21-OHD基因型与临床表型的相关性分析
　　目的：
　　探究72名患者基因型-临床表型之间的关系并复习文献，进一步研究之前文献报导过的国内CAH患者，为临床实践中产前诊断及遗传咨询提供依据。
　　方法：
　　1.将72名21-OHD患者依照其基因型分为四组。
　　2.分析各组之间基因型与表型关系，及基因型与激素水平关系。
　　3.查阅文献，总结分析之前报导过的所有中国CAH患者的基因型-表型相关性。
　　结果：
　　1.在72名患者中共发现了36种基因型。根据以往研究，取两个等位基因中较为轻微的致病突变作为分组依据，共分为四组:0组:12人;A组:26人;B组:16人;C组:11人。
　　2.在基因型最为严重的0组中，所有12名患者均为与之对应的SW型;在A组中，26人中有23人(88.5％)为SW型，另外有1人(3.8％)为SV型，2人(7.7％)为NC型;在B组的16人中，SW型CAH有5人(31.3％)，SV型和NC型分别有6人(37.5％)和5人(31.3％);在C组中，SW型CAH有2人(20％)，SV及 NC型CAH各有4人(40％)。
　　3.在分析患者激素水平时发现，FSH的均值为2.52±2.51 IU/L，LH的均值为1.69±2.52 IU/L，远低于二者的正常值:FSH:5-40 IU/L，LH:5-25 IU/L。我们对FSH和LH进行了ROC曲线分析，计算了曲线下面积(AUC)，发现二者对最严重的SW分型CAH的预测作用的AUC值分别为0.862(CI(95％):0.735-0.943，P＜0.001)和0.669(CI(95％):0.522-0.796, P=0.0364)。
　　结论：
　　1.在本研究中，临床症状较为严重的0组和A组中患者的基因型-表型的相关性最高，在0组和A组中对表型的阳性预测值分别高达100％和85％。然而B组和C组患者基因型-表型相关性一般，B组中仅有31.3％的患者为预测中的SV表型，C组中有36.4％为我们预测的NC型CAH。
　　2.通过对之前报导过的487个病例进行归纳汇总，发现中国CAH患者的基因型与表型高度相关。
　　3.FSH可以用于预测21-OHD的疾病严重程度。
　　第三部分 CYP21A2基因新突变(p.L199X，p.E321del，p.H393Q及p.L459_P464del)的功能学分析
　　目的：
　　为了明确在4名CAH患者中发现的四个CYP21A2基因的新发突变L199X，E321del，H393Q及L459_P464del的意义及其与临床分型的关系，我们对其进行了体外细胞实验研究及三维结构分析。
　　方法：
　　1.以pcDNA3.1为载体，构建CYP21A2的野生型质粒pcDNA3.1-CYP21A2-WT，再在野生型质粒的基础上构建8种突变型质粒，其中4种突变为之前做过功能学研究的已知突变I173N，V282L，P454S和P483S，残存酶活性分别为4.4％，18％，24-38％，54-61％，作为对照作用以评估实验的准确性。另外四种为我们发现的新突变L199X，E321del，H393Q及L459_ P464del。
　　2.将质粒转染COS-7细胞48小时后，在培养基中加入底物孕酮或17-羟孕酮，孵育1小时后提取培养基中的类固醇，检测产物DOC及11-DOC的产量，从而计算野生型及突变型CYP21蛋白的底物转化率。以野生型CYP21蛋白的转化率定义为100％，其他突变蛋白的转化率与其作比，用所得比值表示其对应的残存酶活性。
　　3.以PDB网站上已解析出的人类CYP21蛋白的三维结构模型-4Y8W为模板，利用软件PyMoL来构建CYP21蛋白的四种新突变模型，分析其结构和功能变化。
　　结果：
　　1.四种已知对照突变I173N，V282L，P454S和P483S对孕酮的转化率分别为:9.5±2.4％，41.35±5.2％，48±2.4％，81.3±3.0％;对17-羟孕酮的转化率分别为:9.0±0.6％,44.3±2.8％,55.9±2.3％,81.0±2.0％。
　　2.四种新发突变L199X，E321del，H393Q，L459_ P464del对孕酮的转化率分别为:0.9±0.7％,2.4±0.7％，2.2±0.6％，3.5±1.3％;对17-羟孕酮的转化率分别为:1.1土0.4％，3.0土1.6％，2.5±0.6％，3.6±1.1％。
　　3.对四种新发突变的三维结构分析结果示:突变L199X编码了截短蛋白，笫199-485位的氨基酸残基缺失，从而丧失了蛋白与血红素及底物孕酮的结合位点，无法与二者结合从而严重影响酶的功能;野生型CYP21蛋白中，321位的谷氨酸与345位的亮氨酸存在氢键作用，从而维系蛋白正常的三维结构，而E321del突变后，谷氨酸的缺失导致此氢键作用消失，从而影响蛋白的三维结构;同理，393位的组氨酸与355位的精氨酸存在氢键作用，而组氨酸突变为谷氨酰胺后此氢键作用消失，影响三维结构从而影响蛋白功能;459-464位氨基酸残基的缺失将导致其与310位的组氨酸与475位的组胺酰胺的氢键作用缺失从而影响蛋白功能。
　　结论：
　　1.四种已知对照突变的残存酶活性呈梯度递增的变化，趋势与之前多篇文献报导结果一致，侧面验证实验设计及实施过程均较为可靠。
　　2.体外细胞实验检测到四种新突变都显著降低了相对应的CYP21蛋白的活性，四种新突变对孕酮及17-羟孕酮两种底物的转化率均小于5％。
　　3.四种突变均导致CYP21蛋白的三维结构发生变化，影响蛋白功能，软件分析结果支持细胞实验结果。
　　4.结合酶活性实验结果、三维结构分析及同源性分析推测四种突变对应的临床表型应均为SW型。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 患者临床资料的收集及突变分析

研究对象与方法

结果

讨论

附录

第二部分 21-OHD基因型与临床表型的相关性分析

研究对象及方法

结果

讨论

附录

第三部分 CYP21A2基因新突变(p．L1 99X，p．E321del，p．H393Q及p．L459_P464del)的功能学分析

研究对象与方法

结果

讨论

附录

总结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文

攻读学位期间获得的奖励

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