多巴胺/蜕皮激素受体通过结合20-羟基蜕皮酮调节昆虫的变态发育

摘要

昆虫是地球上数量最多、分布最广的动物群落。昆虫的生长发育主要由保幼激素和蜕皮激素（20-羟基蜕皮酮，20E）协同调控。在昆虫取食生长时期，虫体内保幼激素滴度高，而在昆虫蜕皮变态时期，保幼激素逐渐降低直至零，蜕皮激素滴度逐渐增加。两种激素存在相互作用，既拮抗又统一，协同调控昆虫的蜕皮与变态过程。研究已证明20E存在着经典的基因组信号通路，20E通过自由扩散，或在细胞膜受体介导下，跨越细胞膜进入细胞内，与核受体EcR结合起始基因的转录表达。近些年，科学研究陆续发现了20E的非基因组途径。例如胞内蛋白的快速磷酸化及移位，胞内钙离子动员等。也有研究发现G蛋白偶联受体(GPCR)参与蜕皮激素的非基因组信号途径，而不同的GPCR的作用机制各异。因此GPCR参与20E的非基因组信号通路的问题成为人们的关注热点。本实验室已证明ErGPCR1、ErGPCR2参与20E的非基因组信号通路。在果蝇中发现多巴胺受体(DmDopEcR)也可以结合20E的类似物[3H]PonA，但是多巴胺受体在20E信号通路中的作用机制尚不清楚。本论文以棉铃虫为实验材料开展了相关研究，探究DopEcR在20E信号通路中的作用及机制。
　　结果发现DopEcR在棉铃虫幼虫的不同组织均有表达，包括表皮、中肠、脂肪体和脑，且在脑中的表达量最高，在蜕皮及变态期的脑和中肠中有升高的趋势。20E促进DopEcR的表达。DopEcR参与调控20E诱导的胞内钙离子水平的快速增加、基因表达及昆虫的变态过程。DopEcR定位于细胞膜，且20E诱导下不发生内吞。RNA干扰DopEcR后降低了20E与细胞膜的结合水平，过表达DopEcR后增加了20E与细胞膜的结合水平，纯化后的DopEcR能与20E发生结合，但是其结合位点突变体与20E的结合能力显著降低。我们的研究表明20E上调DopEcR的表达，DopEcR通过结合20E调控昆虫的变态发育。
　　本论文以生化与分子生物学的技术方法进行研究，针对GPCR动态结合20E的特性，设计建立了新的方法，首次在鳞翅目昆虫中证明了DopEcR可以结合20E，为鉴定GPCR结合其它配体提供了借鉴。该研究阐明了DopEcR主要分布在脑，说明了组织分布不同可能是多个GPCR参与20E信号途径的机制之一。本研究首次报道类固醇激素20E可以促进神经系统的分子DopEcR表达，而DopEcR又参与20E途径调控昆虫取食及发育，说明20E与多巴胺系统存在正反馈调控关系，共同调控昆虫生长发育。该研究丰富和完善了蜕皮激素调控昆虫生长发育的理论知识，为20E的非基因组信号途径提供了新的实验证据，为害虫防治提供了新的靶标基因。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

第一节 昆虫生长发育概述

第二节 昆虫生长发育与蜕皮变态的分子机制

一、保幼激素信号通路

二、蜕皮激素信号通路

三、本论文的研究问题、方案及意义

第二章 多巴胺／蜕皮激素受体通过结合20-羟基蜕皮酮调节昆虫的变态发育

一、引言

1．实验材料

2．实验方法

三、结果

1．DopEcR基因序列克隆和分析

2．DopEcR抗体制备

3．DopEcR在不同的组织中表达

4．DopEcR受20E上调

5．干扰DopEcR延迟化蛹

6．DopEcR参与20E应答基因的表达与胞内Ca2+增加

7．DopEcR定位于细胞膜且不发生内吞

8．DopEcR结合20E

四、讨论

1．DopEcR属于GPCR的class A家族

2．DopEcR结合20E在昆虫变态发育中的功能

3．20E通过DopEcR调控胞内钙离子增加和基因表达

4．20E上调DopEcR的表达

五、结论

创新点总结及意义

参考文献

致谢