药用海洋细菌的筛选、鉴定、保藏及药用菌种资源库的建立

摘要

近海潮间带植物生境拥有最富有生物多样性的海洋微生物种群，具有开发新药的巨大潜力。本文对我国南、北方近海潮间带药用盐生植物生境海洋细菌的药用价值、分类、保藏方法等内容进行了较为系统的研究。
　　 与实验室其他同学合作，采用茄链格孢菌(Alternaria solani)筛选模型对实验室分离并保存的2013株海洋细菌进行了抗病原真菌活性测试，获得了140株具有抗菌活性的菌株。采用文献报道并经过课题组改良的14种陆地微生物保存方法，试验、比较了各方法的保藏效果和操作难易程度，初步筛选出了4种操作简便、效果较好的陆地微生物保藏方法，并结合海洋微生物的特征，作出适当改良，最终采用20％无菌甘油悬浮冷冻(-87℃)保存法、无菌海水悬浮保存法、无菌谷粒室温保存法、无菌海沙室温保存法对随机抽取的75株已保存5年以上的药用海洋微生物进行了存活时间测试，同时首次对菌株的药用活性的保持情况进行了测试。结果显示，20％无菌甘油悬浮冷冻(-87℃)保存法对维持菌株的生命活力和药用活性效果最佳，几乎所有菌株在保藏一定年限后能基本保持原有活性。其次是无菌海水悬浮保存法，虽然保藏时间和活性维持情况较前者略低，但总体效果还是较理想。这两种方法操作简便，且无需特殊设备，可用于药用海洋微生物的中、长期保藏。
　　 利用传统形态学、生理生化测试和16SrDNA序列测定相结合的方法对筛选出的活性细菌进行分类鉴定。结果显示，140株有活性的细菌分别属于23个属，35个种，其中芽孢杆菌属(Bacillus)最多，有81株，占总数的57.6％，包含了10个不同的种。其次是弧菌属(Vibrio)和假单胞菌属(Pseudomonas)，分别占12％和7.1％，表现出了较好的多样性。最后以这些菌株为基础(本论文主要负责细菌。真菌和放线菌的筛选和鉴定由实验室其他同学完成)建立了国内首个药用菌株资源库，详细记录所有菌株的学名、采集地点与时间、药用活性、16SrDNA或ITS基因序列、培养条件、菌株保藏等信息。