尿嘧啶衍生物的合成及胸苷酸合成酶抑制剂活性测定方法的建立

摘要

胸苷酸合成酶（Thymidylate Synthase，TS）是一种叶酸依赖性酶，催化生物体内2'-脱氧尿苷-5'-磷酸(dUMP)甲基化形成2'-脱氧胸苷-5'-磷酸(dTMP)，后者进一步代谢为脱氧胸苷三磷酸(dTTP)，dTTP是DNA合成所必需的前体物质，因此TS在细胞增殖中起着非常重要的作用，抑制TS等同于抑制DNA的生物合成，从而抑制肿瘤细胞的生长。近年来，胸苷酸合成酶成为肿瘤化学治疗的热门靶点之一，其抑制剂是抗肿瘤药物研究的一个重要方向。本文主要进行了以下方面的工作:
　　1. TS蛋白的高效表达及纯化:本部分利用实验室自制重组菌株TS-pET-28b(+)/Rosseta(DE3)表达TS蛋白，实验结果得变性条件下TS分子量大小为36.0kDa，目的蛋白在细胞总蛋白中含量占42.1％左右，TS最佳表达条件是:温度37C，IPTG浓度为1.5mM，诱导时间为8h;重组蛋白中含有6×His-tag标记，用Ni-NTA亲和层析进行纯化，最终得到纯度为90％以上的重组TS蛋白。
　　2.胸苷酸合成酶辅因子mTHF的合成:实验中通过正交试验优化反应条件，对反应条件进行探索。从四氢叶酸纯度的角度分析四氢叶酸合成的最佳反应条件为:温度60℃、反应时间1.5h、Na2S2O4加入量为1.5g，四氢叶酸纯度达到66.1％。
　　3.胸苷酸合成酶抑制剂重要中间体的合成:化合物A由尿嘧啶衍生物和喹唑啉环两部分组成。所设计化合物结构新颖无文献记载，查阅了大量的相关文献，总结经验设计如下合成路线。实验两部分分别以尿嘧啶和间甲基苯胺为原料，经羟醛缩合、肟化、水解、氧化、闭环以及自由基溴化等反应，合成了抑制剂A。各步中间体均测定熔点，经过1HNMR等方法得到确证。
　　4. TS蛋白复性及抑制剂活性测定:以提取纯化的人TS为原料，利用氧化-还原转化透析系统进行复性，通过紫外分光光度法测定酶活力，复性后hTS的酶活力为0.0137U，比活力为0.11U/mg。通过测定已知抑制剂培美曲塞(LY231514)和雷替曲塞(Tomudex) IC50值分别为:6.5×10-6M、7.4×10-5M，中间体6-9的IC50值分别为:3.45×10-2M、4.62×10-4M、7.84×10-5M、4.62×10-5M。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 抗叶酸剂类抗肿瘤药物研究进展

1．2 胸苷酸合成酶(TS)

1．2．1 胸苷酸合成酶抑制剂分类

1．3 抗肿瘤药物的研究进展

1．3．1 抗肿瘤药物的分类

1．4 重组蛋白的纯化简介

1．4．1 离子交换法

1．4．2 硫酸铵沉淀法

1．4．3 凝胶层析法

1．4．4 亲和层析法

1．5 蛋白质复性简介

1．5．1 复性机制

1．5．2 复性方法

1．5．3 复性条件

1．6 本课题研究意义及计划方案

1．6．1 课题研究意义

1．6．2 课题研究的计划方案

第二章 TS蛋白的高效表达与纯化

2．1 实验材料

2．1．1 主要实验仪器

2．1．2 实验菌种及质粒

2．1．3 主要试剂及配制

2．2 实验方法

2．2．1 大肠杆菌的诱导表达

2．2．2 SDS-PAGE检测蛋白质分子大小

2．2．3 Bradford法测蛋白质浓度

2．2．4 表达形式分析

2．2．5 单因素实验

2．2．6 正交试验

2．2．7 亲和色谱层析分离蛋白质

2．3 实验结果与分析

2．3．1 目的蛋白的诱导表达

2．3．2 重组人TS表达形式的定位

2．3．3 单因素实验

2．3．4 正交试验优化表达条件

2．3．5 亲和色谱分离纯化重组人TS

2．4 实验小结

第三章 胸苷酸合成酶辅因子mTHF的合成

3．1 实验材料

3．1．1 实验仪器

3．1．2 实验试剂

3．2 实验方法

3．2．1 四氢叶酸的合成

3．2．2 四氢叶酸的鉴定及含量测定

3．2．3 5，10-亚甲基四氢叶酸的合成

3．2．4 5，10-亚甲基四氢叶酸的纯化

3．3 实验结果与分析

3．3．1 四氢叶酸合成实验现象

3．3．2 四氢叶酸鉴定实验现

3．3．3 四氢叶酸反应条件的优化

3．3．4 5，10-亚甲基四氢叶酸的鉴别

3．3．5 实验注意事项

3．4 实验小结

第四章 胸苷酸合成酶抑制剂重要中间体的合成

4．1 中间体化合物的合成分析

4．2 实验仪器和试剂

4．2．1 仪器

4．2．2 试剂

4．3 实验部分

4．3．1 5-羟甲基尿嘧啶(1)的合成

4．3．2 5-氯甲基尿嘧啶(2)的合成

4．3．3 异硫脲盐(3)的合成

4．3．4 5-巯甲基尿嘧啶(4)的合成

4．3．5 异亚硝基乙酰间甲苯胺(5)的合成

4．3．6 4-甲基靛红(6)的合成

4．3．7 2-氨基-6-甲基苯甲酸(7)的合成

4．3．8 3，4-二氢-2，5-二甲基-4-氧代喹唑啉(8)的合成

4．3．9 5-溴甲基-3，4-二氢-2-甲基-4-氧代喹唑啉(9)的合成

4．4 结果与讨论

4．4．1 5-羟甲基尿嘧啶合成

4．4．2 5-氯甲基尿嘧啶的的合成

4．4．3 异硫脲盐的合成

4．4．4 异亚硝基乙酰间甲基苯胺的合成

4．4．5 4-甲基靛红的合成

4．4．6 2-氨基-6-甲基苯甲酸的合成

4．4．7 3，4-二氢-2，5-二甲基-4-氧代喹唑啉的合成

4．4．8 5-溴甲基-3，4-二氢-2-甲基-4-氧代喹唑啉的合成

4．5 本章小结

第五章 TS蛋白复性及抑制剂活性测定

5．1 实验材料

5．1．1 实验仪器

5．1．2 实验试剂

5．1．3 试剂配制

5．2 实验方法

5．2．1 透析袋的预处理

5．2．2 复性蛋白的预处理

5．2．3 变性蛋白的透析复性

5．2．4 蛋白复性得率

5．2．5 酶活力及比活力测定

5．2．6 抑制剂IC50的测定

5．3 实验结果

5．3．1 蛋白质SDS-PAGE电泳分析

5．3．2 TS复性得率测定

5．3．3 TS酶活力U及比活力sp的测定

5．3．4 雷替曲塞(Tomudex)和培美曲塞(LY231514)IC50的测定

5．3．5 系列中间体化合物的IC50的测定

5．4 实验小结

全文结论

参考文献

附录

致谢

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