基于核酸识别的酶活性生物传感新方法研究

摘要

酶作为一种具有生物催化功能的生物大分子，广泛存在动植物体内，支配着生物体的新陈代谢过程，维持机体正常功能。它不仅与生物的生长发育、遗传及神经传导等生命活动息息相关，还与细胞损伤、衰老及各种癌症等疾病的发生有关。近几十年来，酶活性的研究得到越来越多的关注，人们不但探索了生物体内各种酶与DNA的作用机理，还研究了一系列测定酶的活性的方法，这为进一步研究酶的相关性能带来了新的曙光，在生物学上具有重大的意义。生物传感器的研究作为近年来分析化学的重要课题之一，已经得到了广泛的应用。其中利用DNA分子之间碱基互补配对的特异性而构筑的各类以核酸作为分子识别元件的核酸生物传感器吸引了人们的关注。由于其具有简便快速，灵敏度高，稳定性强，生物相容性好等优点而被广泛的应用于临床医学、环境监测等领域。本论文主要建立了几种简便快速、低成本、灵敏选择性检测Argonaute2(Ago2)蛋白的的RNA核酸内切酶的活性及尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性的新方法。
　　论文总共分为四个部分:
　　1、第一部分首先系统的介绍了生物传感器的基本结构、检测原理、分类及应用领域与前景。介绍了DNA生物传感器的工作原理、类型及应用，并重点介绍了电化学DNA生物传感器和荧光DNA生物传感器。然后介绍了纳米材料氧化石墨烯(GO)、特殊的DNA二级结构G-四链体及核酸切口内切酶。最后，简要的概述了Ago2蛋白的概念及UDG的相关内容。
　　2、第二部分基于GO建立了一种新颖的荧光信号放大传感方法检测哺乳动物Ago2蛋白的RNA核酸内切酶活性。Ago2蛋白能够与miRNA形成复合物而表现出RNA核酸内切酶的活性。充分利用GO所具有的高的荧光猝灭效果及对含有不同碱基数目的单链DNA（ssDNA）的亲和力的不同的特性，体系中标记有荧光基团(FAM)的DNA探针分子表现出很弱的背景荧光信号，而当加入Ago2-miRNA复合物后引起目标mRNA的断裂并且释放出连接有FAM的短寡核苷酸片段，FAM基团远离GO表面，使得荧光强度大大增强。而Ago2-miRNA复合物又可从杂交链中释放出来进而引发下一个循环切割反应，荧光信号得以放大。该检测Ago2蛋白RNA核酸内切酶活性的检测方法具有出高灵敏度、新颖简单、低成本等优点，其检测限为1.7nM。
　　3、第三部分利用亚甲基蓝(MB)作为电化学杂交指示剂，基于UDG催化移除尿嘧啶碱基诱导链释放，建立了一种免标记电化学传感平台灵敏检测UDG活性的新方法。利用DNA分子间的杂交识别过程将含有四个尿嘧啶碱基的DNA链自组装到通过电沉积树枝状纳米金修饰的电极表面，经MB嵌插产生电化学信号。当加入UDG后，尿嘧啶碱基被特异性的水解，使得DNA双螺旋结构解开，并且从电极表面释放出嵌插在DNA双螺旋结构中的MB，使得相应的氧化还原电信号显著降低。实验结果显示，该传感体系对UDG的线性响应范围为0.025U/mL到2U/mL，检测限为0.012U/mL。此方法具有高灵敏、高选择性及低成本等优点。另外，该方法首次将电化学检测技术用于检测UDG的活性。
　　4、第四部分基于核酸切口内切酶辅助信号放大策略，建立了一种免标记均相可视化检测碱基切除修复酶活性的新方法。以作为模型，引入含有尿嘧啶碱基的发卡DNA探针1(HP1)和富含有鸟嘌呤(G)碱基DNAzyme序列及切口酶切割序列的发卡探针2(HP2)。当加入UDG后，水解HP1链中的尿嘧啶碱基，引发后面一系列的反应，并结合切口酶的作用引起循环反应过程，最终形成大量的具有模拟HRP活性的G-四链体-heminDNAzyme，用于催化过氧化氢/ABTS体系产生颜色变化，实现了可视化UDG活性的检测。该检测方法具有简单、低成本、高选择性及高灵敏度等优点，在可视化检测其他生物分子领域方面具有极大的潜能。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 生物传感器概述

1．1．1 生物传感器定义及工作原理

1．1．2 生物传感器的分类

1．1．3 生物传感器的特点及应用

1．1．4 生物传感器的应用前景与发展趋势

1．2 DNA生物传感器

1．2．1 DNA生物传感器的研究内容

1．2．2 DNA生物传感器的类型

1．2．3 电化学DNA生物传感器

1．2．4 荧光DNA生物传感器

1．2．5 DNA生物传感器的应用

1．3 纳米材料

1．3．1 纳米材料定义

1．3．2 石墨烯

1．3．3 氧化石墨烯

1．4 G-四链体

1．4．1 核酸简介

1．4．2 G-四链体简介

1．4．3 G-四链体在生物传感器中应用

1．5 核酸切口内切酶

1．5．1 核酸切口内切酶简介

1．5．2 核酸切口内切酶辅助信号放大技术及其应用

1．6 Argonaute2蛋白

1．6．1 Argonaute蛋白家族简介

1．6．2 Ago2蛋白与RNAi

1．6．3 Ago2蛋白的RNA核酸内切酶活性研究

1．7 糖基化酶

1．7．1 糖基化酶简介

1．7．2 尿嘧啶DNA糖基化酶

1．7．3 UDG的功能及应用

1．7．4 UDG活性的测定方法

1．8 立题依据

参考文献

第二章 Ago2蛋白的RNA核酸内切酶活性荧光新方法研究

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 化学试剂

2．2．2 仪器

2．2．3 荧光测量

2．3 结果与讨论

2．3．1 检测Ago2蛋白的RNA核酸内切酶活性的实验方法设计原理

2．3．2 实验条件的优化

2．3．3 荧光检测Ago2蛋白的RNA核酸内切酶活性

2．3．4 构筑的传感平台的选择性

2．4 本章小结

参考文献

第三章 基于酶催化切除尿嘧啶诱导链释放免标记的尿嘧啶DNA糖基化酶活性研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 化学试剂

3．2．2 仪器

3．2．3 准备DenAu修饰的Au电极

3．2．4 S1的固定，S2的杂交和指示剂的嵌插

3．2．5 UDG的活性研究和电化学检测

3．3 结果与讨论

3．3．1 构筑电化学生物传感平台检测UDG活性的原理

3．3．2 生物传感器的电化学行为

3．3．3 实验条件的优化

3．3．4 电化学检测UDG的活性

3．3．5 生物传感器的重复性和稳定性

3．4 本章小结

参考文献

第四章 基于切口内切酶辅助信号放大免标记比色检测碱基切除修复酶活性研究

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 化学试剂

4．2．2 仪器

4．2．3 UDG活性的检测

4．3 结果与讨论

4．3．1 信号放大检测UDG活性的原理

4．3．2 可行性研究

4．3．3 HP 1浓度的优化

4．3．4 UDG活性的检测

4．3．5 UDG活性检测的选择性研究

4．4 本章小结

参考文献

结论

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文

声明