一种基于蛋白质二级结构组合原理构建突变体文库方法的研究

摘要

酶的定向进化是改变酶的结构和性质满足工业化需求的有效途径，现在定向进化技术已被用于上百个酶的进化，大大提高了生物酶的活性和效率，在工业、农业、生物制药等方面产生了巨大影响。酶的定向进化的成功与否主要取决于所构建的突变文库是否具有足够大的多样性及库容量。以易错PCR为代表的随机突变技术和以DNA改组技术为代表的DNA重组技术是目前常用的两种定向进化技术。
　　针对现有的构建文库方法的缺点，本论文设计了一种基于蛋白质二级结构组合原理构建突变体文库的新方法。以原有蛋白质的二级结构单元为模块进行重组，相较于现有的文库构建方法，本方法模块重组多样性高，且并未破坏蛋白质的结构功能单元，形成有功能突变体的几率较高。为便于筛选，以卡那霉素抗性基因作为实验对象。首先分析同源性低的卡那霉素抗性蛋白的结构功能信息，选取其二级结构及重要催化活性中心区域为基本组合模块。以A-T连接及酶切产生粘性末端连接两种方法构建突变体文库。最终，利用本方法筛选得到了10个有效突变体，最高抗性达到1920ng/μL（即为常用卡那霉素抗性的64倍）。
　　综上所述，本论文利用蛋白质二级结构组合原理构建的突变体文库方法，筛选得到了一个卡那霉素抗性显著提高的突变体。本实验必将对现有基因文库难以筛选的一些目标，如预防和治疗新发现的病毒等发挥积极的作用，并可以从中筛选出任意所需要的蛋白质或酶来满足工业、医药业、食品业等多种行业对于蛋白质或酶的需要。

目录

摘要

引言

第一章 综述

1．1 现代生物技术

1．1．1 现代生物技术的应用

1．1．2 基因工程

1．1．3 蛋白质工程

1．1．4 酶的定向进化

1．2 基因文库构建的策略

1．2．1 无性突变

1．2．2 同源性重组

1．2．3 非同源性重组

1．2．4 基于蛋白质结构的重组

1．3 突变体文库的筛选方法

1．3．1 平板克隆筛选

1．3．2 96孔板筛选

1．3．3 噬菌体展示技术

1．3．4 核糖体展示技术

1．3．5 酵母细胞表面展示技术

1．4 本论文研究的目的和意义

第二章 实验方案设计

2．1 引言

2．2 实验方案的设计

2．3 实验内容的确定

2．4 实验中需解决的关键问题

第三章 蛋白质二级结构单元的选择及确定

3．1 引言

3．2 卡那霉素抗性基因的抗性机制

3．3 二级结构单元的选取

3．4 Linker及引物的设计

第四章 A-T连接构建突变体文库

4．1 引言

4．2 实验仪器、试剂及溶液的配置

4．2．1 实验仪器

4．2．2 实验试剂

4．2．3 溶液配制

4．3 实验内容

4．3．1 实验原理

4．3．2 DNA双链的形成

4．3．3 模块重组

4．3．4 重组产物重聚及扩增

4．3．5 琼脂糖凝胶电泳检测

4．3．6 重组产物胶回收

4．3．7 质粒载体的提取

4．3．8 质粒载体及目的基因的双酶切及纯化

4．3．9 目的基因与表达载体连接

4．3．10 DH5α大肠杆菌感受态细胞制备

4．3．11 重组质粒的转化

4．3．12 文库的筛选及鉴定

4．4 结果与讨论

4．4．1 连接条件的优化

4．4．2 重聚PCR条件的优化

4．4．3 胶回收目的长度区域基因及双酶切

4．4．4 质粒载体提取及双酶切验证

4．4．5 重组质粒转化条件优化

4．4．6 突变体文库的多样性验证

4．4．7 突变体文库的有效性验证

4．5 小结

第五章 利用限制性核酸内切酶构建突变体文库

5．1 引言

5．2 实验仪器、试剂及溶液的配制

5．3 实验步骤

5．3．1 实验原理

5．3．2 DNA双链的形成

5．3．3 模块重组及扩增

5．3．4 重组文库的筛选及鉴定

5．4 结果与讨论

5．4．1 连接条件的优化

5．4．2 重聚PCR条件的优化

5．4．3 突变体文库的多样性验证

5．4．4 突变体文库的有效性验证

5．5 小结

结论

参考文献

致谢

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