基因沉默ATF5联合更昔洛韦对HCMV阳性胶质瘤U87细胞增殖及病毒复制的影响

摘要

神经胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，尽管采取积极的治疗措施，预后依然很差。在神经胶质瘤环境中，人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）基因及转录产物的表达随着肿瘤恶性程度的增高而增高，其感染与神经胶质瘤关系密切。转录激活因子5（Activating transcription factor5，ATF5）是肿瘤标志性转录因子，在神经胶质瘤中特异性高表达。本文在神经胶质瘤环境中，探讨基因沉默ATF5联合抗病毒药物更昔洛韦（ganciclovir，GCV）对HCMV阳性胶质瘤U87细胞增殖及病毒复制的影响。研究首先筛选合适的GCV作用浓度；利用慢病毒介导的小干扰RNA靶向干扰ATF5基因的表达，构建ATF5下调稳定表达的LV-ATF5-RNAi U87细胞系；低感染复数(multiplicity of infection, MOI)的HCMV感染 LV-ATF5-RNAi U87细胞，并用含GCV的培养基培养。在该条件下，CCK-8法检测细胞的增殖活性；Real-time PCR、western-blot分别检测HCMV即刻早期（IE）、早期（UL44）、晚期（UL99）基因及蛋白表达水平；空斑形成试验检测HCMV子代病毒复制水平。结果表明：成功构建ATF5下调稳定表达的LV-ATF5-RNAi U87细胞。基因沉默ATF5联合GCV共同作用，可以较好的抑制HCMV阳性神经胶质瘤细胞的增殖活性；基因沉默ATF5联合GCV共同作用对HCMV在mRNA、蛋白水平、子代病毒复制水平上的抑制结果一致，都明显大于GCV或者沉默ATF5单独作用的抑制效率。以上结果提示，基因沉默ATF5联合GCV可以较好的遏制HCMV病毒的复制以及神经胶质瘤的恶性增殖作用。因此，基因沉默ATF5联合GCV共同作用可能为临床上治疗神经胶质瘤提供一个新的方法。

目录

缩略词表

引言

第一章 材料与方法

1.1 主要仪器设备

1.2 主要实验试剂及配制

1.3 细胞及病毒

1.4 细胞培养

1.5 细胞的冻存

1.6 HCMV AD169毒株的制备及定量

1.7 更昔洛韦浓度筛选

1.8 细胞总RNA提取

1.9 RNA反转录成cDNA

1.10 Real-time RCR扩增目的片段

1.11 构建基因沉默ATF5稳定表达的细胞株LV-ATF5-RNAi U87

1.12 蛋白提取及western-blot分析

1.13 统计学方法

第二章 结果与分析

2.1 细胞培养

2.2 病毒空斑形成试验检测HCMV AD169毒株滴度

2.3 更昔洛韦浓度筛选

2.4 慢病毒感染效率检测

2.5 ATF5基因沉默效率的检测

2.6 基因沉默ATF5联合GCV对U87细胞的增殖的影响

2.7 Real-time PCR分析沉默ATF5联合GCV对低MOI值多循环复制的HCMV抑制作用

2.8 Western-blot分析沉默ATF5联合GCV对低MOI值多循环复制的HCMV抑制作用

2.9 沉默ATF5联合GCV对低MOI值多循环复制的HCMV子代病毒复制水平的抑制作用

第三章 讨论

第四章 结论

参考文献

综述:人巨细胞病毒与恶性神经胶质瘤发生发展之间的关系

攻读学位期间研究成果

致谢

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