胶州湾萨氏海鞘(Ciona savignyi)共附生细菌的分离培养、系统发育多样性研究及两株海洋新菌的分类鉴定

摘要

胶州湾地处中国暖温带，其丰富的自然资源和生物资源都与人类生产及生活密切相关。海鞘体内共附生了丰富的微生物，在其体内发现了大量结构新颖且活性显著天然产物，从海鞘中分离共附生微生物将是利用海洋微生物资源的途径之一。本论文利用经典培养技术对胶州湾来源的萨氏海鞘（Ciona savignyi）共附生微生物进行了分离培养及后对分离菌株进行系统发育多样性分析，为海洋微生物的开发利用提供了基础。同时，还利用多相分类法确定2株海洋新菌系统分类地位，丰富了对海洋细菌种质资源的研究，为新基因、新化合物的探索奠定了基础。
　　利用传统平板培养法对胶州湾来源的萨氏海鞘中的可培养细菌共附生细菌进行了分离纯化并根据其16S rRNA基因序列构建neighbor-joining系统进化树进行系统发育多样性分析。研究分离得到17种不同的细菌，它们分别具有不同的菌落特征，主要属于变形菌门、拟杆菌门和放线菌门3个细菌发育类群，α-变形菌纲、γ-变形菌纲、黄杆菌纲和放线菌_c纲4个纲。其中分离得到的菌株中有12株菌属于变形菌门，占所分离菌株的70.6%，为优势类群，且主要属于变形菌门的α-变形菌纲和γ-变形菌纲。
　　对萨氏海鞘中分离得到的细菌利用2216E等4种不同的培养基进行发酵，以大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等5株多重耐药菌为指示菌株，采用琼脂扩散法对发酵产物进行抑菌活性研究。研究发现，能产生抑制屎肠球菌、粪肠球菌和金黄色葡萄球菌的活性物质的菌株数量多于抑制大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏杆菌的菌株；最有利于产生抑菌（供试菌株）物质的培养基是ISP2海洋培养基；菌株H-7、H-8和H-9为易产生活性物质的菌株。
　　利用传统平板培养法，以2216E为分离培养基，从中国胶州湾的萨氏海鞘中分离得到一株海洋细菌H-12T，并对其进行分类鉴定。结果显示，菌株H-12T属于红杆菌科、红杆菌属的一个新种，命名为Amylibacter cionae，其典型菌株为H-12T(=KCTC52581T=CGMCC1.15880T)。其16S rRNA基因序列比对结果显示与Amylibacter属的唯一种Amylibacter marinus2-3T相似性最高为95.3%。其为革兰氏阴性、无鞭毛、杆菌，细胞大小约为0.6-1.1μm×1.5-2.2μm；在2216E平板上培养4天后，形成光滑、不透明、边缘整齐、浅黄色的圆形突起菌落。最适生长条件为25-30°C，3.0-4.0%NaCl，pH7.0-8.0；严格好养菌。过氧化氢酶、氧化酶、明胶酶、水解吐温20，60实验结果为阳性；DNA G+C含量为53.7 mol%；主要的细胞醌为Q-10；主要的脂肪酸为C18:1ω7c和C18:1ω7c 11-CH3；主要的极性脂为磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE），一个未鉴定的氨基脂(AL)、两个未鉴定的磷脂（PL1-2）和一个未鉴定的脂质（L）。
　　用传统平板培养法，以2216E为分离培养基，从中国胶州湾的海水沉积物中分离得到一株海洋细菌T17T，并对其进行分类鉴定。结果显示，菌株T17T属于Marinobacte属的一个新种，命名为Marinobacter bohaiensis，其典型菌株为T17T(=KCTC52710T=MCCC1K03282T)。其16S rRNA基因序列比对结果显示与Marinobacter属的唯一种Marinobacter lacisalsi LMG24237T相似性最高为96.0%。其为革兰氏阴性、由一个端生鞭毛运动的杆菌，细胞大小约为0.6-1.2μm×1.3-2.2μm。菌株T17T在2216E平板培养3天后，形成光滑、不透明、边缘整齐、乳白色的圆形突起菌落；在MH平板上培养3天后，形成光滑、不透明、边缘整齐、浅黄色的圆形突起菌落；最适生长条件为35°C，6.0-10.0%NaCl，pH7.0-8.0；严格好养菌。氧化酶、过氧化氢酶、淀粉酶、水解吐温20，60，80、脲酶、H2S产生实验结果为阳性；DNA G+C含量为63.0 mol%；主要的细胞醌为Q-9；主要的脂肪酸为C12:0、C16:0、C16:010-CH3和Sum feature2。

目录

引言

第一章 胶州湾萨氏海鞘共附生细菌的分离培养、系统发育多样性及活性研究

1.1 实验材料、仪器与试剂

1.2 实验方法

1.3 实验结果

1.4 小结

第二章 一株分离自胶州湾萨氏海鞘的新种Amylibacter cionae sp. nov.的分类鉴定

2.1 实验材料、仪器与试剂

2.2 实验方法

2.3 实验结果

1.4 小结

第三章 一株分离自胶州湾沉积物的新种Marinobacter bohaiensis sp. nov.的分类鉴定

3.1 实验材料、仪器与试剂

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 小结

结论

参考文献

综述

攻读学位期间的研究成果

致谢

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