高能X射线对肺癌骨转移细胞株SPC-A-1BM ERCC1表达的影响

摘要

目的：讨论高能X射线对肺癌骨转移细胞株SPC-A-1BM ERCC1蛋白表达的影响，揭示细胞株SPC-A-1BM对于铂类药物出现耐药性的时间点及建立动物模型后ERCC1蛋白表达情况。 方法：将人肺癌骨转移细胞株SPC-A-1BM培养后，取指数生长期的细胞分为试验组和对照组。将试验组用医用直线加速器6MV X射线照射，每次2Gy，1次/天，共计10Gy。照射完成后，每隔一周取指数生长部分细胞冷冻备用，对照组也取部分细胞冷冻，最后得到5份实验标本。用4%多聚甲醛固定2h，甘油封存，零下200C保存。用免疫组织化学SABC法检测ERCC1的表达情况。用鼠抗人ERCC1单抗试剂盒，根据试剂说明操作：经3%H2O2灭活过氧化物酶；微波抗原修复；滴加血清封闭液；加入鼠抗人ERCC1单抗试剂；滴加生物素二抗；滴加试剂SABC；用DAB显色，用苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。ERCC1阳性表现为细胞核内显示棕黄或棕红色颗粒沉淀，利用高倍显微镜视野计数100个细胞中阳性细胞表达的数目，每张片子不同位置重复5次。动物模型的建立是将对照组和高能射线照射10Gy组的细胞株培养后，取指数生长期的细胞制成悬浊液，用于各10只试验裸鼠的尾静脉接种。接种完成后，在SPF环境下饲养4周后，接受解剖观察裸鼠的成瘤情况。肿瘤组织由病理科制成组织蜡块。将病理切片后，经过脱蜡、水化；双氧水灭活过氧化物酶，蒸馏水反复洗涤后，微波抗原修复，PBS洗涤3次；滴加血清封闭液，室温温育30分，去除多余液体；加入鼠抗人ERCC1单抗试剂，4度冰箱内12h，用PBS液反复洗涤等处理；滴加生物素二抗，37℃，1h；用PBS反复洗涤3次，滴加试剂SABC，37℃，1h，再次PBS反复洗涤3次，DAB显色，苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。同样在高倍显微镜视野下计数100个细胞中阳性细胞表达的数目，每张片子不同位置重复5次。计量资料用均数±标准差（(-)X±s）表示，采用SPSS19.0版软件处理数据，采用X2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。 结果：对照组和实验组照射完成后1～4周不同时间点取得样本的ERCC1蛋白表达为（22.07±6.05%），（47.13±7.32%），（69.51±8.17%），（51.37±9.10%），（31.57±5.89%）。照射后1-3周的ERCC1蛋白表达与对照组比较有显著差异(P＜0.05)。对照组试验裸鼠成瘤6只，实验组成瘤3只；实验组成瘤作用明显减弱。两组的病理切片样本ERCC1蛋白表达无显著差异(P＞0.05)。 结论：人肺腺癌骨转移细胞株SPC-A-1BM在接受高能射线照射后1～3周内出现ERCC1的高表达，提示对铂类药物产生耐药性；细胞株SPC-A-1BM在受到高能X射线照射后用于接种裸鼠过程中,其生成肿瘤的能力减弱。

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学术硕士学位论文

1 细胞株

2 实验试剂、实验动物和实验器材

4 细胞株的培养

5 细胞爬片

将细胞免疫组化专用爬片用浓硫酸浸泡过夜，用清水反复冲洗，清洗去酸，用蒸馏水清洗3次，高温高压消毒备用

图3、4 ：400倍显微镜下ERCC1细胞核阳性表现图

1.2细胞的分类

1.3细胞培养基